梁啟超，沈廣志，魏 濤，武冬梅

(1.牡丹江醫(yī)學院藥學院，黑龍江牡丹江157011;2.牡丹江醫(yī)學院基礎學院，黑龍江牡丹江157011; 3.佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯154007)

黃嘌呤氧化酶(XO)是一種黃素蛋白酶，存在于各種生物體中，可催化體內的嘌呤底物形成尿酸［1］.黃嘌呤氧化酶，XO抑制劑通過抑制體內XO的活性而減少尿酸生成，對高尿酸血癥和痛風產生良好的防治效果，對缺血再灌注損傷、心功能衰竭、內皮損傷具有較好的保護作用［2］，有可能成為治療心血管系統(tǒng)疾病尤其是心衰的藥物.XO由兩個催化活性互不依賴的、相同的亞單位組成，每個亞單位各含一個活性中心，每個活性中心包括四個活性輔助基團:一個黃素核苷酸輔基(FAD)，兩個Fe/S，一個鉬輔因子，鉬輔因子為底物的結合部位［3］.

楊梅酮(3，5，7，3'，4'，5'－六羥基黃酮)又名楊梅素，屬六羥基黃酮類化合物，其結構如圖1所示.具有極高的抗氧化和清除自由基的活性［4－5］，此外，有研究表明楊梅素還具有降血糖、降血脂和保肝護肝等多種生物活性［6］，現已廣泛應用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品［7］.雖然，國內外對于黃酮類作為XO抑制劑，通過測量其體外抑酶活性試驗IC50值，評價其構效關系中涉及到楊梅酮［8］，但涉及兩者作用的光譜性質還未見報道.本文利用紫外光譜法研究楊梅酮與XO之間的相互作用，闡明了它們之間的作用的特點，并為XO抑制劑的篩選研究提供一種簡便經濟、直觀可行方法.

圖1 楊梅酮化學結構

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV757CRT型紫外－可見分光光度計(上海精密科學儀器公司)，吸收池厚度為1 cm;F－A2004電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司);PB－20標準型pH計(德國塞多利斯).

楊梅酮(Sigma公司)用無水乙醇配成1×10－3mol/L儲備液;黃嘌呤氧化酶(Sigma公司)蛋白質量濃度53 g/L，酶活性0.67 u/mg(蛋白)，使用前未經進一步純化，4℃保存?zhèn)溆?PBS緩沖溶液(NaCl 137 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、Na2HPO44.3 mmol/L、KH2PO41.4 mmol/L)pH值為7.4.所用試劑均為分析純，溶液用二次蒸餾水配置.

1.2 實驗方法

實驗時先取3 mL PBS緩沖溶劑加入到標準比色杯中，進行基線校準，消除溶劑對吸光度的影響，再取適量的楊梅酮儲備液加入比色池中，再用pH值為7.4 PBS緩沖溶液稀釋之5×10－5mol/L.測量200～800 nm紫外吸收圖譜.然后將5 μL的黃嘌呤氧化酶加入比色池中(終濃度為60 u/L)，再測量楊梅酮與黃嘌呤氧化酶相互作用不同時間的紫外光譜及吸光度值.實驗在室溫下進行.

2 結果與討論

對于大多數黃酮類化合物來說，紫外光譜主要有兩個吸收峰，其中之一出現在240～280 nm范圍內，是峰帶Ⅱ苯甲酰系統(tǒng)引起的;另一個在300～ 400 nm范圍內，是峰帶Ⅰ桂皮酰系統(tǒng)引起的.黃嘌呤氧化酶含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等氨基酸殘基，這些氨基酸都具有特殊的光學活性.

楊梅酮先通過疏水鍵向XO表面靠近，進入疏水袋，然后發(fā)生并與鉬輔因子螯合，進而被XO催化氧化［9－10］，這是目前最完善的楊梅酮－XO反應機理.黃酮類化合物絡合金屬離子同時將其從高價態(tài)還原至低價態(tài)，還會使含這些離子的金屬酶活性受到抑制，這可能也是黃酮與XO之一［11－12］.

圖2是楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時間的紫外吸收光譜的變化圖.從圖2中看到，在pH值為7.4的PBS緩沖液中，黃嘌呤氧化酶在278 nm處有最大吸收峰(a);楊梅酮的紫外光譜主要有兩個吸收峰帶(b)，最大吸收峰分別為峰帶的Ⅰ376 nm和峰帶Ⅱ的266 nm處;圖2中d到j楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時間的紫外吸收光譜的變化圖.為當楊梅酮與黃嘌呤氧化酶溶液迅速混合后，376 nm處的吸光度在開始的5 min內隨時間迅速下降，發(fā)生明顯的減色效應，吸光值從0.923減小到0.552，吸光度下降了約40%，在5 min到29 min期間，吸光度隨時間緩慢下降到0.323.這說明楊梅酮的峰帶Ⅰ桂皮酰系統(tǒng)結構發(fā)生變化，多酚環(huán)被黃嘌呤氧化酶氧化，C2═C3也同樣被氧化，因此由于共軛體系縮短，以及助色團的減小，這些造成最大吸收峰發(fā)生藍移;同樣，楊梅酮的266 nm處，也發(fā)生顯著的減色效應，吸光值從1.173減小到0.808(0～29 min)，吸光度下降了約31%，這說明楊梅酮的峰帶Ⅱ苯甲酰系統(tǒng)結構發(fā)生變化;與此同時，在331 nm處隨時間逐步出現一個新的最大吸收峰，其吸光值逐步增大，吸光值從0.649增大到1.053(0～29 min)，這一吸收峰應為醌類的吸收特征峰.

圖2 是楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時間的紫外吸收光譜的變化圖

圖3為楊梅酮與黃嘌呤氧化酶作用隨時間在376 nm(■)、331 nm(●)和266 nm(▲)三處的紫外吸收光譜的變化圖(5～29 min).三處分方程別為Y=0.584 67－0.009 17X、Y=0.698 86+0.012 24X和Y=1.022 37－0.007 05X，根據斜率可知它們的k值分別為－9.17×10－4/min、1.224×10－3和－7.05×10－4/min.因此，楊梅酮與黃嘌呤氧化酶為勻速反應，楊梅酮是黃嘌呤氧化酶的“自殺性”底物，這表明其反應速度是受黃嘌呤氧化酶量限制.

圖3 楊梅酮－黃嘌呤氧化酶復合體在376 nm、331 nm和272 nm處時間對吸光值圖

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