董映輝，張朝輝，毛全富，岳 華，余 勁，李 勁

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000；3.四川省爐霍縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 爐霍 626500）

2010年6月，四川省甘孜州爐霍縣12戶牧民的100多頭成年牦牛發(fā)病，根據(jù)流行病學(xué)情況、臨床癥狀、病理解剖學(xué)變化情況初步診斷為沙門氏菌病，隨即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定，現(xiàn)將診斷情況報(bào)告如下：

1 概況與診斷方法

1.1 發(fā)病情況 四川省甘孜州爐霍縣12戶牧民的1 300頭成年牦牛，2010年5月11日開始發(fā)病，發(fā)病一周左右出現(xiàn)死亡，平均每天死亡1～2頭，截至6月2日送檢，發(fā)病100余頭，死亡30余頭。發(fā)病牦牛精神沉郁，食欲廢絕，跪臥，呼吸困難，體溫升高至41.5℃，有輕微神經(jīng)癥狀，鼻腔有膿性分泌物，便秘后腹瀉，糞中帶有腸黏膜和血。隨病程發(fā)展病牛消瘦，眼窩下陷，皮膚彈性降低，后期臥地不起，四肢末梢發(fā)涼，一周后衰竭而死。

1.2 剖解變化 發(fā)病牦牛主要的剖解變化為心包積液；肝脾臟腫大；肺臟水腫出血；真胃出血，胃內(nèi)有未消化的白色凝乳塊；腎結(jié)石，表面有出血點(diǎn)；小腸黏膜脫落，有出血點(diǎn)；大腸出血等。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)

1.3.1 病料涂片鏡檢 采取病死牦牛的心、血、肝臟和脾臟觸片，瑞氏染色，鏡檢。

1.3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采取病死牦牛的心臟、肝、脾、腎臟，接種在營養(yǎng)豐富的TSA瓊脂平板培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h，革蘭氏染色，顯微鏡觀察。

1.3.3 鑒別培養(yǎng) 采上述組織器官病料培養(yǎng)的典型菌落，接種在SS培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后觀察。再將SS培養(yǎng)基中長出的典型菌落接種到伊紅、美蘭、血液瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后觀察。

1.3.4 生化實(shí)驗(yàn) 從TSA瓊脂平板培養(yǎng)基中挑選出具有代表性的菌落10株（編號(hào)為S1～S10），分別接種于微量發(fā)酵管中，置于37℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，每天觀察反應(yīng)情況。

1.3.5 血清學(xué)鑒定 采用玻片凝集法進(jìn)行血清型鑒定。在玻片上用少量生理鹽水稀釋普通營養(yǎng)瓊脂平板上的純化菌落，用微量加樣器吸取沙門氏菌A-F多價(jià)標(biāo)準(zhǔn)診斷血清與之混合均勻，然后觀察。

1.3.6 16SrRNA的擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 將分離得到的細(xì)菌接種于普通營養(yǎng)肉湯中，于37℃振蕩培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)菌基因組DNA，用Peter等設(shè)計(jì)的針對(duì)革蘭氏陰性菌16SrRNA基因引物進(jìn)行16SrRNA擴(kuò)增，引物信息見表1。擴(kuò)增片段經(jīng)膠回收試劑盒純化后與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α工程菌進(jìn)行目的片段克隆，經(jīng)酶切鑒定，菌液PCR鑒定為陽性克隆后再送大連寶生物公司測序。

1.3.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將純化的分離菌接種于普通營養(yǎng)肉湯，置37℃搖床培養(yǎng)18h。菌液用比濁法記數(shù)，將菌液稀釋至5×108cfu/mL，腹腔注射小鼠5只，每只0.2mL，對(duì)照組5只小鼠腹腔注射滅菌普通肉湯（0.2mL/只）。接毒后的小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察其發(fā)病及死亡情況。死亡的小鼠立即剖檢，無菌采取肺臟、肝臟、心血涂片、革蘭氏染色、鏡檢，并在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，同時(shí)觀察病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 病料觸片觀察結(jié)果 病料觸片經(jīng)瑞氏染色，可從鏡檢中觀察到無芽孢、無莢膜，兩極淡染的中等大小桿菌。

2.2 細(xì)菌分離、鑒別培養(yǎng)的結(jié)果 在營養(yǎng)豐富的TSA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18h便長出了明顯的菌落，經(jīng)觀察沿接種線處生長出圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、灰白色、半透明的中等大小菌落，不同器官中分離到的菌落形態(tài)基本一致，各器官分離到的典型菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果均為革蘭氏陰性小桿菌，與直接涂片的菌體形態(tài)相同。在SS鑒別培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃ 24h培養(yǎng)觀察，生長出半透明、灰白色、呈圓珠狀、能溶解膽鹽并有光澤的小菌落；菌落的邊緣色澤淺，中心色澤深，并稍突起。在伊紅、美蘭、血液瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃ 24h培養(yǎng)觀察，伊紅、美蘭培養(yǎng)基上的菌落呈露珠狀、粉紅色、邊緣整齊；血液瓊脂平板上的菌落為灰色圓珠狀，邊緣整齊、中間稍突起，不溶血；肉湯培養(yǎng)基呈均勻混濁，管底部有凝集，呈陽性反應(yīng)。這些特征都與沙門氏菌的培養(yǎng)特性相符。

表1 引物信息

2.3 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分離菌株在三糖鐵瓊脂中產(chǎn)酸，斜面變紅，底層反應(yīng)呈陽性并產(chǎn)生硫化氫（H2S）；乳糖、麥芽糖、蔗糖均為陰性反應(yīng)，對(duì)甘露醇和葡萄糖均為產(chǎn)酸產(chǎn)氣；枸櫞酸鹽和MR試驗(yàn)為陽性反應(yīng)；VP試驗(yàn)和靛基質(zhì)反應(yīng)均為陰性。10株菌均符合雞沙門氏菌的生化特性。

2.4 血清型鑒定 將分離到的10個(gè)菌株分別與沙門氏菌A-F多價(jià)血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這10個(gè)菌株均發(fā)生凝集反應(yīng)，進(jìn)一步用因子血清與10個(gè)分離菌株進(jìn)行凝集反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個(gè)分離菌株均與06、08因子發(fā)生凝集，其中06為2株，08為8株。

2.5 16SrRNA PCR擴(kuò)增、測序及同源比對(duì)分析結(jié)果

2.5.1 16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果和克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 16SrRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1 386 bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，克隆質(zhì)粒酶切片段大小也在1386 bp處，與預(yù)期大小一致，見圖1。

圖1 分離菌的16SrRNA的PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

2.5.2 測序及同源比對(duì)分析結(jié)果 經(jīng)16SrDNA序列測定，擴(kuò)增序列長度為1386bp，用Genbank中Blast工具與Genbank序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示分離菌只與沙門氏菌屬中的腸道沙門氏菌種腸道沙門氏菌亞種具有同源性，同源性最高達(dá)99%。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 接種小鼠于感染后8 h開始死亡，16h全部死亡。解剖死亡小鼠可見肺部出血，肝、脾腫大出血，腸脹氣，并從死亡小鼠的全部內(nèi)臟器官中分離到感染菌，對(duì)照組小鼠未見異常。

3 小結(jié)

根據(jù)12戶牧民牛群的發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、剖解變化情況，綜合實(shí)驗(yàn)室鏡檢結(jié)果、分離培養(yǎng)結(jié)果、16SrRNA測序比對(duì)結(jié)果以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確診該病是由沙門氏菌屬腸道沙門氏菌種腸道沙門氏菌亞種引起的牦牛沙門氏菌病。

牦牛是草原上重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，牦牛沙門氏菌病不僅給牧民造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且被污染的牦牛產(chǎn)品還可能嚴(yán)重危害人類的健康，因此應(yīng)加強(qiáng)該病在草原上的防控。

[1] 劉加文.我國牦?，F(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策 [J].中國畜牧報(bào)，2002，6（2）：6-9.

[2] 羅嘵林.牦牛繁殖科學(xué)研究的新發(fā)展 [J].中國牦牛，1996，（2）：7-9.

[3]Cheung P Y，Chan C W，Wong W.Evaluation of two real-time polymerase chain reaction pathogen detection kits for Salmonella spp in food[J].Lett Appl Microbiol，2004，39：509-515.

[4] Althouse C，Patterson S，F(xiàn)edorka-Cray P.Type 1 fimbriae of Salmonella enteriea serovar typhimurium bind to enterocytes and contribute to colonization of swine in vivo[J].Infect Immun，2003，11：6446-6452.

[5] Humphrey T.Salmonella，stess responses and food safty[J].Nat Rev Microbiol，2004，2：504-509.

[6] Sheng C，Zhao S，Whit D G.Characterization of multiple antimicrobial resistant Salmonella serovars isolated from retail meats[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：1-7.

[7] Faridah Salam，Ibtisam E.Detection of Salmonella typhimurium using an electrochemical immunosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics，2009，（24）：2630-2636.

[8] Chiu C H，Su L H，Chu C S.Salmonella enteica serotype choleraesuis：epidemiology，pathogenesis，clinical disease and treatment[J].Clin Microbio1 Rev，2004，17：311-322.

[9]李慧明，李國緒，羅來春，等.牦牛沙門氏菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1989，15（8）：16-19.

[10]解洪業(yè).牦牛沙門氏菌病的研究現(xiàn)狀、存在的問題與對(duì)策[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2003，33（1）：39-40.

[11]尚海忠，張曉強(qiáng).牦牛副傷寒的診治[J].中國獸藥雜志，2004，40（5）：21.

[12]郭潤亞，高生英，馬建新.牦牛副傷寒的診治[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，183（4）：29-30.

[13]Peter Kuhnert，Selja E.Capaul，Jacques Nicolet，et al. Phylogenetic positions ofclostridium chauvoeiand clostridium septicum based on 16SrRNA gene seque -nces[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1996：1174-1176.