李宜儒，姚衛(wèi)鋒，盛彩虹，李玲杰，尤 聰，展小飛，劉原君，齊蔓莉，劉全忠

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科，天津300052）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）泌尿生殖道感染是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害公眾健康的一種細(xì)菌感染性疾病。Ct的生殖道感染常引起女性盆腔炎、宮頸炎等，常引起男性尿道炎、睪丸炎和前列腺炎等。由于無癥狀性衣原體感染的普遍存在，致使該疾病不易被發(fā)現(xiàn)而得不到及時治療，導(dǎo)致Ct在宿主體內(nèi)持續(xù)存在并引起不孕、異位妊娠等嚴(yán)重并發(fā)癥。目前Ct抗藥性日益嚴(yán)重，且實(shí)驗(yàn)室藥敏結(jié)果仍無法指導(dǎo)臨床實(shí)踐，故闡明Ct致病機(jī)制，尋找免疫優(yōu)勢抗原研制疫苗，是預(yù)防、控制Ct感染的關(guān)鍵。當(dāng)今公認(rèn)的沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體是引起人類和動物一系列疾病的病原，所有這些衣原體都有一個相同的成分：主要外膜蛋白(MOMP)。MOMP暴露于衣原體膜表面，約占外膜蛋白的60%[1]，在維持衣原體結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用。它的抗原決定簇較為復(fù)雜，包括種、亞種、亞群、血清型等抗原決定簇。MOMP是目前研究最多的Ct抗原，也被認(rèn)為是Ct亞單位疫苗最佳的候選抗原[2-3]，已有報道認(rèn)為，從MOMP的多變區(qū)獲得的一段多肽制備的亞單位疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體和顯著的DTH反應(yīng)[4]，但對能否明顯抑制衣原體的生長繁殖結(jié)果不一。本文旨在通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測MOMP蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢表位，確定該蛋白家族多態(tài)性的決定區(qū)及保守區(qū)。

1 材料與方法

1.2 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位預(yù)測以7個氨基酸殘基為一組，分別按Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方案預(yù)測其親水性、表位可能性和抗原性指數(shù)。以ClustalX軟件序列比對分析其多變區(qū)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 衣原體MOMP蛋白多序列比對 沙眼衣原體各血清型A/B/C/D/E/F/H/L1/L3比對后，發(fā)現(xiàn)序列多變區(qū)集中位于N端第90-107、163-183、328-344（圖1）。

沙眼衣原體E型、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體MOMP蛋白序列比對，以E型序列為基準(zhǔn)校對后，多變區(qū)為：80-107、165-178、249-264、332-346（圖2）。

圖1 沙眼衣原體各型MOMP蛋白序列比對Fig 1 The protein sequence regment of Chlamydia trachomatis of different serotypes

圖2 衣原體MOMP蛋白序列比對Fig 2 The regment of Chlamydia MOMP protein

2.2 沙眼衣原體E型株MOMP蛋白二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位分析 生物信息學(xué)方法預(yù)測沙眼衣原體E型株MOMP蛋白的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位（圖3）發(fā)現(xiàn)，多個強(qiáng)表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位為：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

圖3 沙眼衣原體E型株MOMP蛋白二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測Fig 3 The prediction of the secondary structure and B cell epitope of MOMP protein of Chlamydia E

3 討論

沙眼衣原體是目前性傳播疾病研究的熱點(diǎn)。MOMP蛋白的抗原決定簇較為復(fù)雜,包括種、亞種、亞群、血清型等抗原決定簇。直接比較DNA序列，因密碼子通用性將獲得龐大的冗余信息，因而我們選擇了多肽序列分析。

通過多肽的多序列比對，可以將需要分析的區(qū)域大大縮短。比對結(jié)果顯示，沙眼衣原體各血清型多肽序列只在3個區(qū)域存在明顯多態(tài)性---N端第90-107、163-183、328-344區(qū)域。而不同衣原體序列比對結(jié)果示存在明顯多態(tài)性的區(qū)域?yàn)椋篘端第80-107、165-178、249-264、332-346。N端第90-107、163-183、328-344區(qū)域重疊的存在顯示該區(qū)域中有賦予該蛋白特異性的抗原表位并提示其決定了蛋白功能的差異，對衣原體分類有重要意義。同時，在以下對沙眼衣原體E型株的表位預(yù)測中，也證明了這一結(jié)果（圖3豎線區(qū)域）。對各序列總體而言，其序列殘基組成及排序相似度較高，說明蛋白結(jié)構(gòu)有很高的相似度，從進(jìn)化角度提示了MOMP有重要功能，其性質(zhì)保守。

蛋白的結(jié)構(gòu)和其功能密切聯(lián)系，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)迫于成本和技術(shù)還難有突破，因而也制約了對蛋白功能的認(rèn)識，這是目前分子生物學(xué)研究中迫切需要解決的問題[6-7]。試圖直接從氨基酸序列推斷某一蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)或預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)（包括二級和三級結(jié)構(gòu)）是生物信息學(xué)的重要課題之一。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間構(gòu)象的基礎(chǔ)。其形成幾乎全是由于肽鏈骨架中羰基上的氧原子和亞胺基上的氫原子之間的氫鍵所維系。其他的作用力，例如范德華力等，也有一定的貢獻(xiàn)[8]。目前的研究通過建立并完善作用力計(jì)算模型，對二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的精度也日益提高。

以Garnier-Robson法和Chou-Fasman法，都預(yù)測到MOMP蛋白的β折疊比α螺旋的數(shù)量多，可以認(rèn)為蛋白的二級結(jié)構(gòu)以β折疊為主；并且預(yù)測到MOMP蛋白有頻繁出現(xiàn)的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域。因而我們認(rèn)為該蛋白有較為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，存在眾多的轉(zhuǎn)角區(qū)域可作為候選的B細(xì)胞抗原表位。

為獲得對各種衣原體都有作用的抗體，我們以沙眼衣原體E型株MOMP蛋白相對保守的抗原區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)，著重預(yù)測了該區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)和抗原表位，并作出注釋（圖3）。α螺旋、β折疊常位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而不易形成抗原表位；而轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)分子表面，形成抗原表位的可能性較大，從而構(gòu)成蛋白質(zhì)的功能區(qū)域；并且轉(zhuǎn)角中含有相當(dāng)比例的極性殘基，因而轉(zhuǎn)角及其附近比整個分子有更大的親水性[13]，利于與抗體嵌合，而且糖基化以及磷酸化等轉(zhuǎn)譯后的加工通常發(fā)生在β轉(zhuǎn)角或其附近區(qū)域。還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)角這種二級結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中保守性比氨基酸序列的保守性強(qiáng)，這提示β轉(zhuǎn)角對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化都有重要意義[9-12]。同時還必須考慮抗原指數(shù)--抗原指數(shù)與形成抗原表位的可能性成正比。抗原指數(shù)分析結(jié)果表明序列約有19個集中的抗原表位區(qū)域且指數(shù)值較高，在其中篩選活性較強(qiáng)并能表現(xiàn)其活力的區(qū)域還需要綜合分析其結(jié)構(gòu)、親水性及柔韌性等因素。

平衡各因素考慮，筆者認(rèn)為：沙眼衣原體E型株 MOMP蛋白的強(qiáng)表位位于：100-118，216-225，232-245，256-270，300-313，348-356。弱表位為：27-33，45-54，150-158，377-390，364-371。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞缺陷鼠不僅缺乏抗體反應(yīng)，而且不能引起Ct肺感染后的有效的遲發(fā)性超敏反應(yīng); B細(xì)胞缺陷鼠感染后脾細(xì)胞不產(chǎn)生Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(INF-γ)。這些發(fā)現(xiàn)表明，B細(xì)胞在宿主抵抗原發(fā)和繼發(fā)Ct感染中有重要作用，而且對啟動T細(xì)胞反應(yīng)也是必需的。以往的研究表明，人類生殖道Ct再次感染的持續(xù)時間較初次感染縮短，這提示Ct感染可誘生部分的保護(hù)性免疫應(yīng)答。目前已知Ct感染能誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，包括IgG、IgA、IgE等。由于Ct感染發(fā)生在生殖道黏膜，因此生殖道局部的IgA的免疫保護(hù)作用及其機(jī)制倍受關(guān)注。有研究報道，針對MOMP的黏膜分泌的IgA抗體有一定的保護(hù)性作用，Ct特異性IgA能夠通過阻斷Ct對黏膜上皮細(xì)胞的粘附和Ct的集落形成從而阻斷其進(jìn)一步對宿主細(xì)胞的感染，這提示能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平黏膜局部IgA的疫苗可預(yù)防Ct感染。Ct外膜的主要外膜蛋白（MOMP）是誘導(dǎo)體液免疫的重要抗原，Ct表位決定了保護(hù)性抗體的產(chǎn)生，并且作為抗體的特異性靶抗原。一旦表位改變，則中和作用不復(fù)存在，所以Ct感染很難誘導(dǎo)出廣譜長效的體液免疫效應(yīng)。因而我們通過序列分析確認(rèn)了衣原體MOMP蛋白的保守序列，并分析了該序列的潛在抗原表位，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

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