趙愉快,劉仲華,莫卓群
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南 長沙 410128)
虎杖別名花斑竹(polygonum cuspidatum Sieb et Zucc),是蓼科屬多年生草本植物,其干根、莖入藥,性味苦寒[1]。虎杖苷是其有效成分之一,具有強(qiáng)心擴(kuò)血管、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)咳平喘、祛風(fēng)利濕、散瘀、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-4],在臨床應(yīng)用上有重要價值。筆者研究了大孔吸附樹脂對虎杖苷的吸附和解吸特征及效果,旨在為簡化虎杖苷分離工藝和提高收率提供參考。
1.1.1 藥 材 虎杖藥材(湖南美可達(dá)生物資源有限公司)。
1.1.2 試 劑 乙腈(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司);甲醇、乙醇(分析純);水(蒸餾水);D101、AB-8、HPD-100、HPD-500(安徽三星樹脂科技有限公司);虎杖苷(湖南美可達(dá)生物資源有限公司)。
1.1.3 儀器和設(shè)備 HH數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市金域國勝實驗儀器廠);DHG-9154A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);SK3300H超聲波清洗儀(上??茘u超聲儀器有限公司);予華SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);ZK-82B型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠);AE-240電子天平(METTER TOLEDO公司);800-1電動離心機(jī)(江蘇金壇榮華儀器制造有限公司);Waters 1525高效液相色譜儀、2487雙通道紫外可見檢測器、2707自動進(jìn)樣器。
1.2.1 樹脂的預(yù)處理 將新購買 D101、AB-8、HPD-100、HPD-500樹脂分別用95%乙醇在室溫下密封浸泡24 h,使其充分溶脹;濕法裝柱;用2倍樹脂體積的95%乙醇,以2 BV/h的流速通過樹脂床[5],直至流出的乙醇沖洗液與蒸餾水等量混合無混濁,并在紫外波長200~400 nm范圍內(nèi);檢測除了乙醇本身的吸收外無其它吸收為止,后備用。
1.2.2 虎杖苷的HPLC法測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。(1)精密稱取虎杖苷64.8mg,分別于25mL棕色容量瓶中,80%甲醇溶液溶解并定容至刻度。分別取上述對照品溶液 1,2,4,6,8mL 于 25mL 棕色容量瓶中,用80%甲醇溶液定容至刻度,得5個不同濃度的對照品液。
(2)上樣液的制備。稱取1 g虎杖細(xì)粉,分別加入5、4、3倍量80%甲醇液,60℃,磁力攪拌提取3次,時間分別3、2、2 h,所得濾液混和,減壓濃縮至40%醇過濾,濾液繼續(xù)濃縮至無醇味,加等體積的蒸餾水超聲過濾,濾液即為上樣液。
(3)虎杖苷含量的測定。依利特色譜柱Hypersil ODS2C18(4.6×200 mm),流動相為乙腈∶水(23∶77);柱溫:25℃;流速為 1 mL/min;檢測波長 303 nm;進(jìn)樣量為5μL。
1.2.3 虎杖苷靜態(tài)吸附和解吸試驗 分別稱取D101、AB-8、HPD-100、HPD-500 經(jīng)預(yù)處理后的大孔吸附樹脂各2.00 g,置于100mL錐形瓶中,向瓶中加入25 mL上樣液,室溫下(25℃),搖床震蕩吸附12 h,轉(zhuǎn)速120 r/min。吸附平衡后,過濾出溶液,取上清液5μL測定虎杖苷的質(zhì)量濃度。將吸附飽和樹脂用蒸餾水洗至無色,置于100mL錐形瓶中,加入25mL 70%乙醇,連續(xù)震蕩解吸12 h。測定解吸液中虎杖苷的質(zhì)量濃度,計算出樹脂的靜態(tài)吸附量、解吸率。找出適合虎杖苷分離的吸附樹脂。
靜態(tài)吸附量(mg/g)=[(吸附前溶液中虎杖苷的濃度-吸附后溶液中虎杖苷的濃度)×溶液體積]/樹脂總重量(g)
靜態(tài)解吸率(%)=[解吸液虎杖苷量/(吸附前溶液中虎杖苷量-吸附后溶液中虎杖苷)]×100
1.2.4 虎杖苷動態(tài)吸附和洗脫試驗 (1)上樣液濃度的確定。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂6份,每份2.00 g,裝入玻璃柱(φ1.2 cm×18 cm)中,吸取樣液 6份,每份10 mL,分別加入 0、10、20、30、40、50mL 蒸餾水,制成虎杖苷濃度分別為 3.04、1.51、1.01、0.76、0.61、0.51 mg/mL 的 上 樣液,混勻后上柱,以3 BV/h的流速通過玻璃柱,收集過柱液,檢測虎杖苷含量。
(2)上柱液流速對吸附的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂5份,每份2.00 g,裝入玻璃柱(φ1.2 cm×18 cm)中,吸取樣液5份,濃度為0.76 mg/mL,以不同流速通過玻璃柱,收集過柱液檢測虎杖苷含量??疾?1、2、3、4、5 BV/h 的流速對樹脂吸附率的影響。
(3)乙醇濃度對解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂4份,每份5.00 g,裝入玻璃柱(φ1.2 cm×18 cm)中,吸取樣液4份,濃度為0.76mg/mL,以流速為3 BV/h通過玻璃柱4BV柱體積水洗后,再用3 BV不同濃度乙醇2 BV/h洗柱,收集解吸液檢測虎杖苷含量??疾?0%、50%、70%、95%乙醇濃度對樹脂解吸率的影響。
(4)洗脫劑流速對解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂4份,每份5.00 g,裝入玻璃柱(φ1.2 cm×18 cm)中,吸取樣液4份,濃度為0.76mg/mL,以流速為3 BV/h通過玻璃柱,4 BV柱體積水洗后,再用4 BV 70%濃度乙醇不同流速洗柱,收集解吸液檢測虎杖苷含量??疾?、2、3、4 BV/h流速對樹脂解吸率的影響。
(5)乙醇用量對解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂2.00 g,裝入玻璃柱(φ1.2 cm×18 cm)中,吸取濃度為0.76 mg/mL上樣液,以流速為3 BV/h通過玻璃柱,4 BV柱體積水洗后,再用70%濃度乙醇2 BV/h洗柱,收集解吸液檢測虎杖苷含量??疾?1、2、3、4、5 BV 乙醇用量對樹脂解吸的影響。
1.2.5 虎杖苷產(chǎn)品純度的測定 根據(jù)以上試驗確定的最佳條件,進(jìn)行產(chǎn)品純度驗證。取等體積的上樣液兩份,一份直接濃縮、真空干燥得產(chǎn)品A。另一份上樣液根據(jù)上面試驗確定最佳條件過HPD-500樹脂,解吸下來的洗脫液分別進(jìn)行濃縮、真空干燥得產(chǎn)品B。將二產(chǎn)品進(jìn)行HPLC檢測。
取上樣液適量離心,離心液過0.45μm微孔濾膜,進(jìn)樣測定峰面積值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算質(zhì)量濃度。對照品和上樣液的HPLC圖譜見圖1,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)分別得線性方程:y=3 348 432 x-10 630,r2=0.999 9,線性范圍為 0.1~
0.8 mg/mL。
不同樹脂的物理參數(shù)及對虎杖苷靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果見表1。從表1中可看出,HPD-500型大孔吸附樹的吸附量和解析率均為最高。是虎杖苷的最適分離樹脂。
2.3.1 上柱液濃度對吸附率的影響 上柱液濃度對吸附率的影響結(jié)果見表2。結(jié)果表明:上樣液中虎杖苷質(zhì)量濃度過低或過高均不利于吸附的進(jìn)行,上樣液虎杖苷質(zhì)量濃度在0.76 mg/mL時,吸附量達(dá)到最大27.9mg。上樣液較稀時,上樣液粘度較小,在一定上樣流速下,溶液通過柱床流速較快,虎杖苷不能有效被樹脂吸收,部分虎杖苷直接流出;如果上樣溶液濃度太大,被吸附物質(zhì)在樹脂內(nèi)部擴(kuò)散速度變慢,使樹脂局部吸附快速達(dá)到飽和,部分虎杖苷還沒來得及被吸附就流出來,這兩種情況均未達(dá)到樹脂的最大吸收。
圖1 虎杖苷對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖
表1 不同樹脂的物理參數(shù)及對虎杖苷靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果
表2 上柱液濃度對吸附率的影響
2.3.2 上柱液流速對吸附的影響 上柱液流速對吸附的影響結(jié)果見圖2。從圖2可知,上柱液流速太快,會導(dǎo)致吸附率降低。主要原因是上柱液跟樹脂的接觸時間太短,虎杖苷來不及被樹脂有效吸附就直接流出。流速慢有利于樹脂對虎杖苷的吸附,但是流速太慢,會使作業(yè)周期增長,浪費(fèi)時間。試驗結(jié)果表明,吸附時,流速以取2 BV/h為好。
圖2 上注液流速對動態(tài)吸附率的影響
2.3.3 乙醇濃度對解吸的影響 乙醇濃度對解吸的影響結(jié)果見圖3。結(jié)果表明:HPD-500樹脂用70%乙醇解吸時解吸率高,提高乙醇濃度對解吸率影響很小,因此,應(yīng)選擇70%乙醇為洗脫劑。
圖3 不同濃度乙醇洗脫劑對虎杖苷解吸率的影響
2.3.4 洗脫劑流速對解吸的影響 洗脫劑流速對解吸的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知,洗脫流速在1~2 BV/h時有較好的洗脫效果。為提高生產(chǎn)效率,洗脫流速確定為2 BV/h。
圖4 洗脫劑流速對解吸率的影響
2.3.5 乙醇用量對解吸的影響 乙醇用量對解吸的影響結(jié)果見圖5。從圖5可知,解吸率隨洗脫劑用量的增加而提高,洗脫劑用量為4 BV和5 BV時兩者的解吸率相近,從節(jié)能的角度考慮,乙醇洗脫劑用量宜選擇4 BV。
圖5 乙醇用量對虎杖苷解吸率的影響
大孔樹脂純化效果見表3。從表3中可以看出,上柱后總虎杖苷的轉(zhuǎn)移率為91.5%左右,二者總虎杖苷含量相差2.6倍,說明HPD-500樹脂對虎杖苷起到了很好的吸附效果。
表3 大孔樹脂純化效果
不同類型的樹脂對虎杖中虎杖苷的吸附性能為極性(HPD-500)>弱極性樹脂(AB-8)>非極性樹脂(D101、HPD-500),顯示極性樹脂和弱極性樹脂對虎杖中虎杖苷有較好的吸附性能。解吸率也同樣以HPD-500最大。原因可能是虎杖苷分子帶有2個酚羥基,具有多酚的結(jié)構(gòu),顯弱極性,可以作為一個良好的氫鍵供體,另外它接了1個葡萄糖分子,增強(qiáng)了虎杖苷的極性,有利于極性大孔樹脂吸附。
通過對HPD-500的動態(tài)吸附研究,選用0.76 g/mL上樣溶液,2 BV/h的流速過HPD-500吸附,用4BV70%的酒精洗脫為虎杖苷的最佳吸附分離條件。上樣溶液經(jīng)HPD-500的吸附分離虎杖苷的含量百分?jǐn)?shù)從12.3%上升到32.0%,提高了近2.6倍。
研究結(jié)果表明,HPD-500樹脂具有吸附快、吸附量大,易解吸等特點,優(yōu)于其他幾種樹脂,是一種較理想的吸附分離介質(zhì)。試驗研究確定的虎杖苷分離工藝為進(jìn)一步純化虎杖苷提供了借鑒,亦為綜合利用虎杖苷提供了參考。
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