金 瀟，顏冬云，秦文秀

（青島大學化學化工與環(huán)境學院,山東 青島 266071）

有機磷農藥（Organophosphorus pesticides，Ops）是一種在環(huán)境中廣泛使用的殺蟲劑，具有高效、廣譜等優(yōu)點，自20世紀60年代以來，逐漸取代了有機氯農藥。

隨著有機磷農藥的大量使用，其負面影響日益突出。殘存于作物、土壤或水體中的有機磷農藥，經物理遷移或化學轉化，最終通過食物鏈的傳遞和富集作用影響人類及其他有益生物體[1]。1999~2001年，Abdel-Halim等[2]對一殺蟲劑制造廠污水管道附近的污水、底泥和魚類進行采樣研究，結果表明，6份不同季節(jié)的樣品中均存在毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪農、甲基嘧啶磷和溴丙磷。其中，毒死蜱在所有的水樣和底泥樣品中為主要污染物，濃度范圍分別為 24.5～303.8 ng/L、0.9～303.8 ng/L，二嗪農在魚類樣品中為主要污染物。

有機磷農藥的降解方式主要分為生物降解、光化學降解、化學降解等3種，其中微生物降解具有操作簡單、成本低、代謝繁殖快，對污染物氧化完全，不會產生二次污染等優(yōu)點[3-5]。為此，本文綜述了有機磷農藥微生物降解技術，以期為環(huán)境中有機磷農藥的消解提供技術支撐。

1 降解菌種類

目前，人們已分離出多種能降解有機磷農藥的微生物菌群，其中包括細菌、放線菌、真菌和一些藻類。

由于細菌具有生化多適應性及易誘發(fā)突變菌株等優(yōu)勢，故其在微生物降解中占有重要地位[6-7]。至今，已分離到的細菌主要有：假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬 （Baccillus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）、沙雷氏菌屬（Serratia sp.）等。金彬明等[8]從被有機磷污染的海水樣中分離篩選出一株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株，在28℃下對甲胺磷（5mg/L）的降解率達48.9%。解秀平等[9]從污水曝氣池中分離得到一株能以甲基對硫磷及其降解中間產物對硝基苯酚為唯一碳源的節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）菌株，在5 h內對50mg/L的甲基對硫磷和對硝基苯酚的降解率分別為85%和98%。

真菌因其高效的降解能力正逐漸引起人們的重視，主要有：曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、酵母菌等。顏世雷等[10]通過長期搖床馴化培養(yǎng)從污染土壤中篩選出兩株可在高濃度氧化樂果環(huán)境下生長的曲霉菌株，在28℃時對氧化樂果的降解率分別為70.38%和61.28%。此外，某些藻類對有機磷農藥也有一定的降解作用，如小球綠藻屬（Chorolla）能降解對硫磷、甲拌磷等[11]，但這方面的研究相對較少。

2 降解菌獲得途徑

目前，獲得可降解有機磷農藥微生物的途徑主要有 3種，如下。（1）從受污染的土壤、水體底泥、污水處理廠出口的污泥等受污染的環(huán)境介質中，進行篩選、馴化、富集和分離。王華等[12]采用室內培養(yǎng)方法，從長年施用樂果的土壤中分離篩選出一株能在高濃度樂果中生長的，且以樂果為唯一碳源的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株，該菌株對樂果的平均降解量為1 306.33 mg/L·60 h。廖金英等[13]從土壤中分離篩選出兩株菌株，經鑒定分別為頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）和糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）。在甲胺磷濃度為500 mg/L，30℃，180 r/min搖床上基質培養(yǎng)72 h，對甲胺磷的降解率分別達到58.49%和65.80%。Zeinat等[14]從農業(yè)廢水中分離篩選出5株以馬拉硫磷為唯一碳源和磷源的細菌菌株，經鑒定，4株為產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes），1株為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。其中，蘇云金芽孢桿菌在馬拉硫磷的液體培養(yǎng)基上生長良好，經培養(yǎng)15 d后對馬拉硫磷的降解率達91%以上。（2）定向培育優(yōu)良菌種是近年來倍受關注的方法。該方法通過人為多次施藥，在土壤中培育可降解該農藥的微生物。如，劉文海等[15]從被甲胺磷廢水污染的湖泊中分離細菌樣品，以甲胺磷為唯一碳源和能源，經定向篩選，得到一株可高效降解甲胺磷的巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）菌株。氣相色譜測定結果表明，此菌株對甲胺磷的降解率在48 h和96 h分別為49.24%和98.20%。（3）利用化學誘變劑或其他誘變方法獲得新的降解菌。武曉煒等[16-17]通過紫外誘變育種從假單胞菌（Pseudomonas sp.）S-2中篩選出一株S-232。試驗表明，S-232在30℃、搖床220 r/min的條件下，6d后，對甲胺磷的降解率達到74%，與菌株S-2的降解率相比，提高了8%～9%。

3 微生物降解機理研究

微生物對有機磷農藥的降解方式可分兩類。

一類是微生物直接作用于有機磷農藥[18]，其實質是酶促反應，包括氧化、脫氫、還原、水解、合成等作用，主要是微生物本身含有可降解該農藥的酶系基因。或者，雖然微生物本身并無可降解該有機磷農藥的酶系[19]，但在農藥脅迫下，微生物的基因發(fā)生重組或改變，產生了新的降解酶系。Mageong等[20]報道大腸桿菌產生的磷酸三酯酶能打開P=S鍵。路楊等[21]分離出的菌株可以不同程度地打斷甲胺磷中的P=N鍵、P=O和P=S鍵，完全轉化為PO43-。阮少江[22]研究發(fā)現(xiàn)，甲胺磷經甲胺脫氫酶（MADH）催化后，P=N鍵被打開脫氨基，同時可檢出一定量的甲醇、PO43-和CH3SH。由此，他推測自然界中甲胺磷的降解很可能是從P=N的斷裂開始的。對于微生物在其他種類有機磷上的降解方式，有不同的報道。Liu等[23]在分離到的抗輻射不動桿菌USTB-04降解甲基對硫磷的過程中，沒有發(fā)現(xiàn)任何中間產物和最終產物。由此，他推測出USTB-04首先促使苯環(huán)上的C-C鍵發(fā)生斷裂而非作用于P=O鍵。

另一類是微生物的活動改變了微環(huán)境功能而間接促使農藥降解。常見的作用方式有3種。（1）礦化作用。其指微生物直接以有機磷農藥作為生長基質，將其完全分解成無機物如CO2和H2O等的過程。石利利等[24]研究了假單胞菌DLL-1在水溶液介質中降解甲基對硫磷的性能、影響因素及其降解機理。結果表明，DLL-1菌能將甲基對硫磷完全轉化為無機離子NO2-、NO3-，中間產物為對硝基苯酚。李曉慧[25]從長期受毒死蜱污染的污水處理池中分離到一株毒死蜱高效降解菌株，該菌株能在24 h內完全降解100mg/L的毒死蜱。（2）共代謝作用。其指微生物在有可利用碳源存在時，對原來不能利用的物質進行分解代謝的現(xiàn)象。艾濤等[26]分離到一株以共代謝方式降解樂果的真菌菌株L3，該菌株在120 h內對樂果的降解率達29.2%。王永杰等[27]從污泥中分離出一株以共代謝方式降解樂果的菌株G1，對樂果的降解率達60%以上。（3）種間協(xié)同代謝。指同一環(huán)境中的幾種微生物聯(lián)合代謝某種有機磷農藥。在這種情況下，培養(yǎng)混合菌是一種可行的解決辦法。對此，Douglas[28]曾做過嘗試性研究。

4 影響微生物降解的因素

溫度、pH值、農藥初始濃度、微生物類型、外加碳氮源等因素均會影響微生物對有機磷農藥的降解。

喬楠等[29]在研究廢水中樂果降解菌的篩選及作用條件時發(fā)現(xiàn)，20~42℃，在一定pH值范圍內，樂果都能被降解。其中，以pH值為7.0、30℃時的降解效果最好。此外，隨著pH值的升高，降解率下降。儀美芹等[30]分離到3株能以甲基對硫磷為碳源和能源的真菌，包括2株木霉菌（Trichodermasp.）和1株鏈格孢菌（Alternariasp.）。在30℃左右，3株真菌都生長良好；低于10℃時生長緩慢，高于40℃生長受到抑制；在pH值為7時，3菌株的降解率最高。此外，他們還發(fā)現(xiàn)農藥初始濃度對降解率有影響，菌株對有機磷農藥濃度有一定的適應范圍。秦坤等[31]分離篩選出3株能降解樂斯本的真菌，分別為土生曲霉組（Aspergillus terreus）、長梗串孢霉屬（Monilochaetes）和煙色曲霉組（Aspergillus fumigatus）。這3株真菌均能以樂斯本為唯一碳源，5 d內對50 mg/L樂斯本的降解率分別達93.53%、91.37%、83.45%，且受初始濃度影響。隨著外加碳源濃度的升高，這3種真菌的生長量都明顯增加，但降解率降低，生長量與降解率不呈正相關關系。Anwar等[32]從污染土壤中篩選出一株高效降解毒死蜱及其代謝產物的短小芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus）菌株C2A1。研究發(fā)現(xiàn)，C2A1在不同pH值、接種濃度、外加碳源和營養(yǎng)源以及毒死蜱不同濃度等培養(yǎng)條件下，菌株對毒死蜱的降解能力不同。吳春先[33]在探究環(huán)境條件和微生物對滅線磷降解的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量和溫度的增加，滅線磷的降解速度加快，微生物對滅線磷的降解效果受到顯著影響。在30℃、含水量為40%條件下，未滅菌土壤中滅線磷的半衰期為16.6 d，滅菌土壤中滅線磷的半衰期為31.6 d。有機質對滅線磷的降解也有顯著影響，有機質含量高，有利于滅線磷的降解。此外，滅線磷在堿性土壤中的降解速度比在酸性土壤中的快。30℃、含水量為40%的條件下，滅線磷在3種土壤中的降解速度依次為：東北黑土＞廣東紅土＞山東砂壤土。Zhao等[34]從長期受甲胺磷污染的土壤中分離到一株真菌菌株ZHJ6草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），ZHJ6可以分別利用葡萄糖和甲胺磷為唯一碳源和氮源，還可以利用乙醇、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等為碳源和能源來降解甲胺磷。在無機鹽培養(yǎng)基中，pH值5.0、25℃、1%的葡萄糖為菌株適宜降解條件。甲胺磷起始濃度為1.0×10-3mg/mL，培養(yǎng)12 d后，ZHJ6對甲胺磷的降解率達到99.9%。此外，ZHJ6在葡萄糖存在的條件下還可降解氧化樂果、辛硫磷、草甘磷，但不能降解毒死蜱、速滅磷、敵百蟲、敵敵畏。因此，對其降解機理還有待深入研究。鄭永良等[35]從長期受有機磷農藥污染的土壤中分離到一株降解菌HS-A32，能以甲胺磷作為唯一的碳源和氮源。HS-A32菌降解甲胺磷的最適溫度為30℃，最適pH值為7.0，最適降解濃度為1 000mg/L，降解率達82%。HS-A32菌能以多種碳、氮源生長，外加可利用的碳源和氮源能促進其對甲胺磷的降解。經鑒定，HS-A32為不動桿菌屬（Acinetobacter），該菌還能降解甲基對硫磷等多種有機磷農藥。劉玉煥等[36]利用選擇性培養(yǎng)基從農藥廠的廢水流經地中分離到一株能高效降解樂果的絲狀真菌，經鑒定為曲霉（Aspergillus），它能以樂果為唯一碳源和能源。在pH值7.0、30℃時，液體發(fā)酵120 h后，離心收集菌體處理的樂果，有機磷農藥降解轉化為無機磷的效率達87%，除Cu2+對菌株的降解率有促進作用外，金屬絡合劑（鄰菲羅啉、聯(lián)吡啶和EDTA）和其它實驗中的金屬離子如Ba2+、Al3+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Cr3+、Ag+、Hg2+、Fe3+、Cd2+、Li+對菌株的降解率有不同程度的抑制作用，對菌株的生長未產生明顯的影響。此外，Cu2+對菌株的促進作用有濃度限制。

微生物對有機磷農藥的降解受很多因素影響，且不同環(huán)境因素對微生物降解作用的影響差別很大。如何克服環(huán)境條件的影響，使微生物菌群對有機磷農藥的降解發(fā)揮最大效能，是未來研究時需解決的關鍵問題之一。

5 微生物降解的廣譜性

眾多學者的研究表明，一種有機磷農藥可以被多種微生物降解；同時，由于有機磷農藥結構的相似性，一種微生物也可對多種有機磷農藥進行降解，體現(xiàn)了微生物種類的多樣性以及某些微生物功能的多樣性。

有機磷農藥種類繁多，在環(huán)境中往往不是單獨存在的，因此人們希望找到一種能廣譜性降解有機磷農藥的微生物菌群。江玉姬等[37]從農藥廠附近的土壤中分離、篩選到一株能高效降解MP、辛硫磷、三唑磷和敵敵畏的玫瑰單胞菌屬細菌（Roseomonas），其對 MP、辛硫磷、三唑磷和敵敵畏的降解率分別為96%、99%、98.9%、69.0%。Kazufumi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)桿菌B-5可以降解異唑磷、二嗪農、對硫磷、苯硫磷、殺螟硫磷、異柳磷、毒死蜱、滅線磷等多種有機磷農藥，降解速率因底物不同而異。其中，B-5降解異唑磷的能力最強，1 h內能完全降解濃度為10mg/L的異唑磷。劉玉煥等[36]采用富集、誘變分離方法成功獲得一株高效降解有機磷農藥樂果的真菌，它對其他有機磷農藥的降解同樣有效，如甲胺磷、馬拉硫磷、對硫磷。這表明該菌株的降解特性具有廣譜性。Liu等[39]分離純化得到的青霉菌屬BP303能夠通過斷裂P=O和P=S鍵來降解多種有機磷殺蟲劑，如甲基對硫磷、對氧磷、蠅毒磷、內吸磷-s、亞胺硫磷和馬拉硫磷等。

6 降解酶的固定化技術

固定化技術是近些年來興起的一種對酶的處理技術，主要是應用物理或化學的方法使酶與不溶于水的大分子載體結合。與普通的游離酶相比，固定化酶在保持原有酶催化反應特性的同時，提高了穩(wěn)定性，可以多次使用，應用前景廣闊。

目前，國內外采用的酶固定化技術主要分為4種類型：吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。郭軍等[40]采用一種新型的聚集體交聯(lián)酶固定化技術，對有機磷降解酶固定化酶的性質和應用形式進行了研究。結果表明，有機磷降解酶固定化酶的半衰期在70℃時比游離酶提高2.1倍。該學者所采用的酶固定化技術成效顯著，有待深入分析。

7 基因工程菌的研究與應用

近年來，隨著生物工程技術的發(fā)展，國內外研究者開始構建具有超強降解能力的基因工程菌，強化有機磷的降解。Wang等[41]通過基因工程使有機磷水解酶（OPH）基因在一株煙草植物中得到表達。煙草植物細胞在生長培養(yǎng)基上可以分泌出OPH并且對甲基對硫磷具有抗性。在培養(yǎng)14d之后，轉基因植物對0.02%（v/v）甲基對硫磷的降解率達到99%。鄧敏捷等[42]從產堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）中克隆出有機磷降解酶基因ophc2，將其在大腸桿菌中誘導表達，并驗證其生物學功能。酶學測定結果表明，經異丙基硫代β-D-半乳糖苷酶（IPTG）誘導4 h后，重組蛋白的酶活性是原菌的10倍。

8 結語

微生物降解有機磷農藥具有廣闊的應用前景，但目前主要研究成果是在實驗室條件下完成的，其應用推廣還有很大的局限性。未來關注的熱點應主要集中在以下兩方面：篩選高效有機磷降解菌，并通過基因工程菌的構建提高其降解效率；開發(fā)降解酶制劑產品，使有機磷農藥的微生物降解技術得以商品化。

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