孫鳳娥 劉玉霞 許鄭林 胡潔

近年來(lái)，糖尿病和乳腺癌的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。大量研究顯示，糖尿病患者發(fā)生乳腺癌的危險(xiǎn)顯著增加，糖尿病與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。白介素-6(IL-6)是一種多效性細(xì)胞因子，對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有重要意義。目前有關(guān)葡萄糖和胰島素對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞分泌IL-6的影響，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)體外檢測(cè)不同濃度的葡萄糖和胰島素對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響，為分析糖尿病與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞株為小鼠乳腺癌細(xì)胞株(4T1腫瘤細(xì)胞，河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室凍存);IL-6、βactin引物(上海生工生物工程公司合成);Prime Script PT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(寶生物工程有限公司);PCR擴(kuò)增試劑TaKaRa TaqTM(寶生物工程大連有限公司)。

1.2 4 T1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 4T1腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，以2×105/ml的濃度接種于RPMI 1640培養(yǎng)基(其中含10%的胎牛血清，100 U/m l的青霉素，100 μg/ml的鏈霉素)中，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24～48 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。根據(jù)培養(yǎng)液加入葡萄糖和胰島素濃度的不同，將實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞分為15組:A組(對(duì)照組)只加RPMI1640培養(yǎng)液(不含葡萄糖和胰島素);B組RPMI 1640培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖;C組RPMI1640培養(yǎng)液+10 mmol/L葡萄糖;D組RPMI 1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖;E組RPMI1640培養(yǎng)液+35 mmol/L葡萄糖;F組RPMI 1640培養(yǎng)液+5μU/ml胰島素;G組RPMI 1640培養(yǎng)液 +25μU/ml胰島素;H組 RPMI 1640培養(yǎng)液125μU/ml胰島素;I組 RPMI 1640培養(yǎng)液 +250μU/m l胰島素;J組RPMI 1640培養(yǎng)液+1.25μU/m l胰島素;K組 RPMI 1640培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖+5μU/m l胰島素;L組RPMI 1640培養(yǎng)液+5 mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰島素;M組RPMI1640培養(yǎng)液+25mmol/L葡萄糖+125μU/ml胰島素;N組RPMI1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖+5μU/ml胰島素;O組RPMI 1640培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖 +1.25μU/m l胰島素。

1.4 細(xì)胞總RNA提取 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1腫瘤細(xì)胞以終濃度1.5×105/ml接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O 組均設(shè)雙復(fù)孔，每孔培養(yǎng)總量 3 m l，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280的比值以驗(yàn)證RNA的純度，比值＞1.8時(shí)方可用于RT-PCR檢測(cè)。

1.5 cDNA合成及PCR反應(yīng) 取總RNA 1μg，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA。β-actin和IL-6的引物經(jīng)premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)中所用引物濃度均為10μmol/L。β-actin的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 350 bp。上游:5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游:5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’。IL-6 的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為582 bp:上游:5’-CACGGCCTTCCCTACTTCACA-3’，下游:5’-GGCATAACGCACTAGGTTTGCC-3’。

β-actin的擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。IL-6的擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，59℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl于2%瓊脂糖凝膠上電泳，置于紫外透射儀下觀察并拍照。

1.6 凝膠電泳圖像分析 將凝膠電泳圖像輸入凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。結(jié)果判定以IL-6與內(nèi)參照β-actin的PCR產(chǎn)物條帶灰度值之比(IL-6/β-actin)作為反映IL-6表達(dá)水平的相對(duì)指標(biāo)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的葡萄糖對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響 D、E組IL-6 mRNA的表達(dá)［分別為(0.90±0.17)和(0.91±0.16)］高于A組(0.47±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而B(niǎo)、C組IL-6 mRNA的表達(dá)［分別為(0.57±0.13)和0.60±0.18)］與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度葡萄糖組4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)Mar:DNA Marker

2.2 不同濃度的胰島素對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響 F、G、H、I、J組4T1腫瘤細(xì)胞 IL-6 mRNA的表達(dá)［分別為(0.54±0.14)、(0.57±0.05)、(0.58±0.05)、(0.61±0.12)和(0.58±0.12)］與A組(0.473±0.06)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 不同濃度的葡萄糖和胰島素同時(shí)作用對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響 M、N、O組IL-6 mRNA的表達(dá)［分別為(0.91±0.12)、(0.90±0.16)和(0.91±0.10)］均高于 A 組(0.47±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而K、L組IL-6 mRNA的表達(dá)［(0.58±0.18)和(0.61±0.19)］與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 不同濃度胰島素組4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)Mar:DNA Marker

圖3 不同濃度葡萄糖和胰島素組4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)Mar:DNA Marker

3 討論

在2型糖尿病的自然病程中，血漿葡萄糖和胰島素濃度的變化貫穿于病程的始終。其中高葡萄糖血癥是2型糖尿病的典型特征。有資料顯示，糖尿病患者IL-6表達(dá)水平升高［2，3］，推測(cè)高血糖導(dǎo)致了胰島細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌IL-6增加;陳思嬌等［4］發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清IL-6水平高于健康對(duì)照組，而血糖控制良好者IL-6濃度與健康對(duì)照組無(wú)差異，相關(guān)分析顯示IL-6水平和胰島素濃度關(guān)系不大，但與血糖濃度呈顯著正相關(guān);高濃度葡萄糖能促進(jìn)IL-6的生成在體外實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高濃度的葡萄糖能夠上調(diào)4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá);胰島素濃度的變化不影響4T1腫瘤細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá)。與以往研究結(jié)果一致。提示在糖尿病整個(gè)病程中，IL-6分泌增多系由高葡萄糖血癥所致，胰島素濃度對(duì)IL-6分泌的影響較小。

IL-6由活化的單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞等分泌，具有多種生物學(xué)活性。大量研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移與體內(nèi)產(chǎn)生的IL-6密切相關(guān)［5，6］。在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6在乳腺癌組織的表達(dá)明顯高于其在正常乳腺組織中的表達(dá)［7］;乳腺癌患者與健康女性相比，血清中IL-6濃度較高［8］;乳腺癌患者中IL-6血清水平升高是其預(yù)后不佳的標(biāo)志［9］?，F(xiàn)已闡明，IL-6可通過(guò)多種途徑產(chǎn)生腫瘤免疫抑制作用［10-12］:(1)能抑制抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈功能;(2)能促使腫瘤細(xì)胞合成大量前列腺素E2(PGE2);(3)抑制T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF);(4)促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，抑制IL-12的合成;(5)能拮抗TIL細(xì)胞的細(xì)胞毒性等。另外，IL-6能激活癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，致使細(xì)胞生存期延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖、分裂能力增強(qiáng)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，高濃度的葡萄糖能夠促進(jìn)體內(nèi)正常細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞IL-6分泌增加，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。因此，對(duì)于糖尿病患者以及糖尿病伴有乳腺癌的患者，應(yīng)該嚴(yán)格控制血糖，減少IL-6的分泌，以抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命。

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