黃磊 石冰 宋慶高 王龑 鄭謙

哺乳動(dòng)物繼發(fā)腭的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及到將口鼻腔正確分離的幾個(gè)過程的協(xié)調(diào)一致，從腭突產(chǎn)生(胚胎12 d)、上抬(胚胎13 d)到兩側(cè)腭突相對(duì)運(yùn)動(dòng)接觸直至融合(胚胎14 d)，最后覆蓋在口腔側(cè)和鼻腔側(cè)的黏膜分別分化為復(fù)層鱗狀上皮和假?gòu)?fù)層纖毛狀上皮，這些過程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生改變都可引起腭裂。目前發(fā)現(xiàn)titf2和重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGFβ3)基因突變與這種先天畸形密切相關(guān)。Titf2-/-小鼠［1］和人類甲狀腺轉(zhuǎn)素因子-2(TTF-2)［2，3］基因純合缺陷表現(xiàn)為腭裂及甲狀腺發(fā)育不全等畸形，TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突變也可引起腭裂。在小鼠發(fā)育過程中，TTF-2有促進(jìn)甲狀腺前體細(xì)胞遷徙，抑制甲狀腺前體細(xì)胞在遷徙過程中分化功能［4］，但對(duì)腭中嵴上皮細(xì)胞遷徙是否有影響，尚不清楚。TGFβ3主要在腭中嵴上皮細(xì)胞表達(dá)，在腭突黏附時(shí)起關(guān)鍵作用。本研究旨在觀察在繼發(fā)腭發(fā)育過程中，TTF-2和TGFβ3相互作用變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (1)成年C57BL/6J小鼠購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物中心，雌鼠4～6周，體重12.0～14.5 g，雄鼠＞6周齡，體重＞20 g，保持12 h晝夜周期制，室溫控制在20～25℃，充足食物，自由飲水(pH值為5)。(2)按雌雄比例2∶1于頭晚20∶00至次日晨8∶00合籠，并于次日晨檢查雌鼠，有陰道栓者為交配陽性，定此日為妊娠零天，記為受孕天數(shù)GD0。(3)于妊娠12、13、14 d分別斷頸處死各6只鼠，無菌條件取出胚胎，用眼科剪解離腭突。

1.2 主要試劑 TTF-2羊抗小鼠多克隆IgG購(gòu)自Santa Cruz，Actin(I-1q)羊抗小鼠多克隆IgG購(gòu)自Santa Cruz，產(chǎn)品編號(hào)SC-1616，Protein DetecterTMWestern Blot Kit BCIP/NBTSystem 購(gòu)自KPL公司(產(chǎn)品號(hào)55-11-50)，SABC-AP免疫組化試劑盒購(gòu)自博士得公司，產(chǎn)品編號(hào):SA105，APES購(gòu)自中山公司產(chǎn)品編號(hào)ZII-9001、組織細(xì)胞蛋白裂解液RIPA購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3 組織蛋白提取 (1)每100毫克腭突組織加入1 ml RIPA和10μl PMSF，在冰水浴中電動(dòng)勻漿。勻漿后冰水浴放置30 min。(2)將樣品轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管，4℃ 20 000 g離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中備用。

1.4 Western印記檢測(cè)TTF-2 取上清液10μl經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸素纖維膜上，1%酪蛋白封閉1 h后，加入1∶500稀釋的羊抗鼠TTF-2多克隆抗體IgG于4℃孵育過夜，于4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗膜后，1∶2 000稀釋的AP一兔抗羊IgG于37℃孵育30min，PBS洗膜后，BCIP/NBT顯色。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TTF-2和TGFβ (1)切片制備:將12、13、14 d胎鼠，從口角剪開，顯露腭突，給胚胎頭部矢狀平面連續(xù)切取6μm厚切片數(shù)張，切片貼于經(jīng)2%APES防脫片劑打底的載玻片上，經(jīng)丙酮固定后-20℃貯存?zhèn)溆谩?2)冰凍切片免疫組織化學(xué)染色步驟:滴加正常兔或山羊血清封閉液，室溫20 min，滴加抗TTF-2IgG(1∶100 稀釋)或抗TGFβ3 IgG(1∶50 稀釋)一抗，4℃過夜，滴加生物素化二抗，室溫20 min，滴加SABC-AP，室溫20 min，BCIP/NBT顯色，核固紅輕度復(fù)染，干燥后水溶性封片劑封片。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6J 12、13、14 d胎鼠腭突TTF-2表達(dá)Western印記結(jié)果。見圖1、表1。

圖1 TTF-2表達(dá)Western印記

表1 TTF-2表達(dá)Western blotting灰度掃描測(cè)量結(jié)果n=6，±s

表1 TTF-2表達(dá)Western blotting灰度掃描測(cè)量結(jié)果n=6，±s

.00 12 d 13 d 14 d 15 d TTF-2/β-actin 6 310±1 506 7 649±2 379 6 279±1 473 0.00±0

2.2 妊娠12、13、14、15 d胎鼠腭突TTF-2表達(dá)變化，從折線圖可見隨著腭突的發(fā)育，TTF-2表達(dá)變化趨勢(shì):TTF-2在胎胚13 d時(shí)表達(dá)最多，在胚胎14 d時(shí)表達(dá)明顯比13 d時(shí)減少，胚胎15 d時(shí)已不能檢測(cè)到TTF-2表達(dá)。見圖2。

圖2 TTF-2變化趨勢(shì)

2.3 TTF-2、TGFβ3在C57BL/6J 14 d胎鼠腭突冰凍切片免疫組化染色。TTF-2和TGFβ3主要位于腭突中嵴上皮細(xì)胞核及核膜上，其免疫組化染色陽性部位在胞核及核膜。在12 d胚胎中，腭突從上頜突伸出呈垂直位，在腭突的上皮細(xì)胞中有TTF-2免疫組化染色陽性細(xì)胞，在間充質(zhì)中則為零星分布，此時(shí)未見TGFβ3染色陽性細(xì)胞。胚胎13 d時(shí)，腭突在舌體上方呈水平位，TTF-2在腭突表面上皮細(xì)胞中，染色強(qiáng)度較12 d時(shí)明顯增強(qiáng)，此時(shí)在腭突上皮細(xì)胞中亦可見TGFβ3染色陽性細(xì)胞。14 d時(shí)，兩側(cè)腭突已接觸，腭突表面為單層上皮細(xì)胞，可見TTF-2染色陽性細(xì)胞，但染色強(qiáng)度明顯較12 d時(shí)低，此時(shí)可見TGFβ3染色最明顯。見圖3、4。

圖3 胚胎14 d TTF-2在腭突表達(dá)(免疫組化×200)

圖4 胚胎14 d TGFβ3在腭突表達(dá)情況(免疫組化×200)

3 討論

3.1 腭突融合機(jī)制 腭突發(fā)育過程中，在腭突垂直生長(zhǎng)期(12 d)腭中嵴上皮細(xì)胞為兩層，腭突上抬呈水平方向生長(zhǎng)后(13 d)中嵴上皮細(xì)胞由兩層變一層。這有助于腭突發(fā)生接觸(14 d)時(shí)兩側(cè)腭突上皮細(xì)胞快速相互插入至間充質(zhì)細(xì)胞而融合。遺傳和(或)環(huán)境因素干擾，可對(duì)人和動(dòng)物胚胎組織腭突中嵴上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸造成不利的影響。黃磊等［4］研究了地塞米松(DEX)對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腭突融合過程的影響，發(fā)現(xiàn)DEX促進(jìn)了腭中嵴上皮分化成復(fù)層鱗狀上皮，引起腭突融合障礙，提示腭中嵴上皮的正常轉(zhuǎn)歸對(duì)腭突的融合有決定性作用。

3.2 小鼠腭突發(fā)育過程中TTF-2表達(dá)的時(shí)空性 TTF-2是甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子，為磷酸化蛋白，分子量42 kDa，編碼基因Titf2［5］。titf2-/-小鼠［1］和人類 TTF-2［2，3］純合突變均會(huì)引起甲狀腺發(fā)育缺陷和腭裂。小鼠發(fā)育過程中TTF-2表達(dá)有時(shí)空性及雙相性，可抑制甲狀腺遷徙過程中特殊上皮細(xì)胞--甲狀腺濾泡細(xì)胞分化成熟［5］。為了更好地理解TTF-2在腭突形成中的作用，我們使用羊抗小鼠TTF-2多克隆抗體IgG，采用免疫組織化學(xué)和western blot方法，原位和半定量詳盡研究了小鼠胚胎發(fā)育的12、13、14 d，TTF-2在小鼠腭突中表達(dá)變化情況。在C57BL/6J小鼠胚胎的腭突形成(12 d)，上抬(13 d)和融合(14 d)的發(fā)育過程中，TTF-2的表達(dá)以13 d為最高，免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果一致，均證實(shí)了這一點(diǎn)，說明腭突中嵴上皮細(xì)胞的分化抑制在13 d時(shí)達(dá)高峰，隨著腭突的發(fā)育TTF-2表達(dá)減少。TTF-2在12、13、14 d的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，胚胎15 d時(shí)，已不能檢測(cè)到 TTF-2表達(dá)，這與15 d腭突上皮開始分化相一致，此時(shí)口腔腭突上皮分化為復(fù)層鱗狀上皮，鼻腔分化為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮。

3.3 小鼠腭突發(fā)育過程中TGFβ3表達(dá)的時(shí)空性 TGFβ3-/-小鼠和人TGFβ3突變均可引起腭裂，TGFβ3在腭突中嵴上皮細(xì)胞的黏附過程中起重要作用。我們研究結(jié)果顯示:在腭突形成時(shí)(胚胎12 d，E12 d)腭突中嵴上皮未檢測(cè)到TGFβ3表達(dá)。但當(dāng)腭突上抬呈水平方向生長(zhǎng)時(shí)(E13d)，首次在腭中山嵴上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TGFβ3表達(dá)，隨著兩側(cè)腭突接觸、黏附、融合(E14 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中的表達(dá)最明顯，當(dāng)腭突融合完成后(E15 d)，TGFβ3在腭中嵴上皮中表達(dá)減少。在腭突發(fā)育過程中，間充質(zhì)細(xì)胞中未見TGFβ3表達(dá)。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎13 d時(shí)，腭中嵴上皮表層細(xì)胞開始出泡，形成絲狀偽足，增加了細(xì)胞表面積為兩側(cè)腭突腭中嵴上皮細(xì)胞黏附作準(zhǔn)備。小鼠胚胎14 d時(shí)，兩則腭中嵴上皮細(xì)胞相互插入形成細(xì)胞間黏附，小鼠胚胎15 d，兩側(cè)腭突融合完成。腭突發(fā)育的這些形態(tài)學(xué)改變與TGFβ3表達(dá)變化及其功能是相吻合的。

Pelton等［6，7］研究 TGFβ3主要分布在腭突中嵴上皮細(xì)胞，在間充質(zhì)中也有少量分布，而本研究在13、14、15 d胚胎腭突中嵴上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TGFB3表達(dá)與其研究結(jié)果相同，而未在間充質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，這一點(diǎn)與他們研究略有不同。

3.4 TGFβ3和TTF-2的相互作用對(duì)小鼠腭突發(fā)育的影響TGFβ3和TTF-2兩種細(xì)胞因子均與腭突中嵴上皮細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)歸相關(guān)。我們觀察到在腭中嵴上皮細(xì)胞中TGFβ3的出現(xiàn)較TTF-2延遲1 d，二者均在表達(dá)后一天出現(xiàn)峰值，TTF-2的表達(dá)變化對(duì)TGFβ3表達(dá)高峰的出現(xiàn)是有影響的。在腭突上抬為水平方向(E13d)，TTF-2表達(dá)達(dá)高峰，表現(xiàn)為強(qiáng)烈抑制腭中嵴上皮細(xì)胞分化，使腭中嵴上皮由2層轉(zhuǎn)為一層，便于兩側(cè)腭中嵴上皮細(xì)胞相互插入。此時(shí)由于TGFβ3的出現(xiàn)，腭中嵴上皮細(xì)胞表面出泡，形成絲狀偽足，當(dāng)兩側(cè)腭突接觸時(shí)(E14d)，TTF-2表達(dá)急劇下降，解除對(duì)TGFβ3表達(dá)抑制，使其表達(dá)達(dá)高峰，有助于此時(shí)部分腭中嵴上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，另一方面促進(jìn)兩側(cè)腭中嵴上皮細(xì)胞黏附。

TGFβ3-/-鼠和titf-2-/-鼠均可出現(xiàn)腭裂，筆者推測(cè)二者的協(xié)調(diào)一致，可能是促使腭突正常融合必要條件，而這種平衡一但受干擾(無論外源性或內(nèi)源性)則有可能引起腭突發(fā)育障礙最終導(dǎo)致腭裂。

1 De Felice M，Ovitt C，Biffali E，et al.A mouse model for hereditary thyroid dysgenesis and cleft palate.Nat Genet，1998，19:395-398.

2 Clifton-Bligh RJ，Wentworth JM，Heinz P，et al.Mutation of the gene encoding human TTF-2 associated with thyroid agenesis，cleft palate and choanal atresia.Nat Genet，1998，19:399-401.

3 Castanet M，Park SM，Smith A，et al.A novel loss-of-functionmutation in TTF-2 is associated with congenital hypothyroidism，thyroid agenesis and cleft palate.Hum Mol Genet，2002，11:2051-2059.

4 黃磊，石冰，孫晉虎，等.地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)A系小鼠腭突腭中嵴上皮融合的影響.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，23:103-105.

5 Zannini M，Avantaggiato V，Biffali E，et al.TTF-2，a new forkhead protein，shows a temporal expression in the developing thyroid which is consistentwith a role in controlling the onset of differentiation.EMBO J，1997，16:3185-3197.

6 Pelton RW，Hogon BLM，Miller DA，etal.Differential expression of genes encoding.TGFs beta1，beta2，and beta3 during murine Palate formation Dev Biol，1990，141:456-460.

7 Lidral AC，Murray JC，Beutow KH，et al.Studies of the Candidates genes TGFB2，MSX1，TGFA，and TGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the Phillipines.Cleft Palate Craniofac J，1997，34:1-6.