唐中偉，周志江

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.天津大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，天津 300072）

腸道出血性大腸桿菌（EHEC）O157∶H7會(huì)引起腸道疾病[1-6]、溶血性尿毒綜合征及腦癥等并發(fā)癥[7]，其主要致病因子是志賀毒素（Stx）。Stx分為2類，即Stx1和Stx2。Stx2又有數(shù)個(gè)變異型，主要是Stx2，Stx2c和Stx2d。Stx2不同變異型對培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物的毒性有差異[8]，引起的臨床癥狀輕重也不同[9]。

因此，研究該菌Stx2的分型對闡明毒素的分類、正確診斷疾病和判斷疾病的預(yù)后都具有重要意義。我國1987年報(bào)道從腹瀉患者中分離出該菌[10-11]，同時(shí)也從牛肉、豬肉及牛糞樣品中分離出該菌[12]。我國江蘇和廣西等地從人和動(dòng)物多次檢測出該菌[13-14]。本研究選取3株國內(nèi)分離的EHEC菌株，對其Stx2基因進(jìn)行克隆和測序，以確定它們的分類地位。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

EHECO157∶H7菌株94H分離自山東一腹瀉患者；EHEC O157∶H7菌株094和EHEC O8菌株042分離自牛糞[12]。受體菌DH5α、質(zhì)粒載體pMD-18 Tvector為寶生物大連有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

PCR試劑盒、氨芐青霉素（AP）和DL 2000 Marker購自寶生物大連有限公司，DNA回收試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)中心。

1.3 Stx2基因的擴(kuò)增

根據(jù)Stx2基因序列設(shè)計(jì)合成1對引物，分別是 Stx2u:5′GGAACACCTGTATATGAAGTG3′和 Stx2d:5′GTTACCCACATACCACGAATG3′。兩引物跨越整個(gè)Stx2基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1282 bp。PCR后做瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，于紫外檢測儀下觀察。

1.4 Stx2基因的連接和轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物純化后，連接到pMD－18 T vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，在含AP的SOB平板培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色菌落，接種于含AP的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，再按上述PCR擴(kuò)增條件鑒定重組效果。

1.5 Stx2基因的核苷酸序列分析

由寶生物大連有限公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Stx2基因的擴(kuò)增和克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物約1282 bp，與預(yù)期大小相符。經(jīng)重組轉(zhuǎn)化后，從轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒作為模板，再做PCR，同樣擴(kuò)增出了約1282 bp DNA片段（圖1），表明已克隆出各菌株的Stx2基因。

2.2 Stx2基因的核苷酸序列分析及其編碼的氨基酸序列分析

用Stx2u和Stx2d引物分別測得3株菌的Stx2的序列，用計(jì)算機(jī)軟件DNASIS分析它們與業(yè)已發(fā)表的Stx2，Stx2c，Stx2d序列的同源性。

經(jīng)分析（圖2），EHEC 94H的Stx2序列與標(biāo)準(zhǔn)株Stx2核苷酸序列同源性為99.8%，EHEC 042的Stx2序列與Stx2核苷酸序列同源性為98.9%，EHEC 094的Stx2序列與Stx2核苷酸序列同源性為97.9%。

經(jīng)分析（圖3），EHEC 94H的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為99.5%，EHEC 042的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為98.9%，EHEC 094的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為98.0%。

經(jīng)分析（圖4），94H的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為90.9%，042的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為90.5%，094的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為87.1%。

經(jīng)分析（圖5），EHEC 94H與042的Stx2核苷酸序列同源性為98.8%，與094的Stx2核苷酸序列同源性為97.9%。

Stx2，Stx2c，Stx2d 序 列 和 94H，094，042 的Stx2序列分別編碼的B亞基氨基酸序列比較如下（每組從上至下依次為Stx2，Stx2c，Stx2d序列和94H，042，094的Stx2序列）:

經(jīng)比較（圖6），EHEC 094的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2d序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%，EHEC 94H的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%；EHEC 042的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為97.7%。

3 討論

Stx2變異型的不同，表現(xiàn)為它們抗原性和毒性有所不同，主要是它們B亞基序列的不同所致，而B亞基的不同又決定了毒素與什么樣的受體結(jié)合或決定與受體結(jié)合的親疏。由于94H，094，042的Stx2序列核苷酸密碼發(fā)生了改變，因而編碼出的氨基酸也發(fā)生了改變。特別是B亞基氨基酸序列發(fā)生改變，對于3株EHEC國內(nèi)分離菌株的生物學(xué)特性會(huì)產(chǎn)生一定的影響。

經(jīng)DNASIS軟件分析，從人類患者分離的94H的Stx2序列編碼的B亞基與標(biāo)準(zhǔn)株Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%；從牛糞分離的菌株042的Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株Stx2序列編碼的B亞基的同源性為97.7%，屬于較強(qiáng)毒株；從牛糞分離的菌株094的Stx2序列編碼的B亞基與強(qiáng)毒株Stx2d編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%。目前，已證明Stx2d的毒性大于Stx2，由此可以預(yù)見，094產(chǎn)生的毒素與受體結(jié)合強(qiáng)度較94H和042強(qiáng)，可能導(dǎo)致的毒性也較強(qiáng)。

上述分析明確了我國分離的產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌，特別是大腸桿菌O157∶H7的Stx2基因型及其毒素分型，這為開展分子流行病學(xué)調(diào)查和及時(shí)準(zhǔn)確診治其感染，控制其在我國的流行，也為下一步研究菌苗和抗體提供了依據(jù)。

［1］Vial P A ，Robins-Browne R，Lior H，et al.Characterization of enteroadherent-aggregative Escherichia coli，a putative agent of diarrheal disease[J].J Infect Dis，1988，158:70-79.

［2］ Levine M M，Prado V，Robins-Browne R，et al.Use of DNA probes and HEp-2 cell adherence assay to detect diarrheagenic Escherichia coli[J].J Infect Dis，1988，158:224-228.

［3］張雪寒，何孔旺，盧維彩，等.出血性大腸桿菌O157∶H7 Stx2B-Tir-Stxl B多價(jià)融合蛋白表達(dá)及免疫原性研究 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25（4）:180-185.

［4］ Bhan M K，Khoshoo V，Sommerfelt H，et al.Enteroaggregative Escherichia coli and Salmonella associated with nondysenteric persistent diarrhea[J].Pediatr Infect Dis J，1989，8:499-502.

［5］Cravioto A，Tello A，Navarro A，et al.A ssociation of Escherichia coli HEp-2 adherence patterns with type and duration of diarrhea[J].Lancet，1991，337:262-264.

［6］Wanke CA，SchorlingJ B，Barrett LJ，et al.Potential role ofadherence traits of Escherichia coli in persistent diarrhea in an urban Brazilian slum[J].Pediatr Infect Dis J,1991，10:746-751.

［7］ Li Y，F(xiàn)rey E，Mackenzie A M，et al.Human response to Escherichia coli O157:H7 infection:antibodies to secreted virulence factors[J].Infect Immun，2000，68（9）:5090-5095.

［8］Mellon-Celsa AR，Darnell SC，O’Brien AD.Activation ofShiga－like toxins by mouse and human intestinal mucus correlates with virulence of enterohemorrhagic Escherichia coli O91∶H21 isolates in orallyinfected，streptomycin-treated Mice[J].Infection and Immunity，1996，64（5）:1569-1576.

［9］ Nishikawa Y，Zhou Z，Hase A，et al.Relationship of Genetic Type of shiga toxin to the Manifestation of Bloody Diarrhea due to Enterohemorrhagic Escherichla coli of Serogroup O157∶H7，F(xiàn)indingin Osaka City，Japan[J].Journal of clinical Microbiology，2000，38（6）:2440-2442.

［10］權(quán)太淑.首次從出血性結(jié)腸炎病人中分離到O157∶H7大腸桿菌[J].中華流行病學(xué)雜志，1988，9（腹瀉病特刊）:24.

［11］汪力亞，黃上媛，王麗，等.腸出血性大腦埃希氏菌O157∶H7型檢測方法的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1999，15（1）:64-65.

［12］周志江，黃上媛，汪力亞，等.從長春地區(qū)牛糞中檢出產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O157∶H7[J].中國人獸共患病雜志，2000，16（5）:104-105.

［13］汪華，李洪衛(wèi)，倪大新，等.淮北部分地區(qū)O157:H7大腸桿菌感染性腹瀉并發(fā)急性腎衰爆發(fā)的流行病學(xué)研究[J].中華流行病學(xué)雜志，2004，25（2）:125-128.

［14］李永紅，林玫，王鳴柳，等.廣西腸出血性大腸埃希菌O157監(jiān)測研究 [J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（10）:1027-1029.