張曉軍，暢志堅(jiān)，閻曉濤，詹海仙，李 欣

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

小麥白粉病（Blumeria graminis f.sp.tritici）是影響小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要病害之一，近年來(lái)有愈來(lái)愈流行的趨勢(shì)，培育和推廣抗病品種是控制該病害流行的有效措施。小麥的野生近緣種屬植物中蘊(yùn)藏著許多對(duì)小麥品種改良非常重要的基因，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交等方法選育附加系是利用近緣種屬有益基因的重要途徑[1-2]。

中間偃麥草對(duì)小麥白粉病免疫[3]，具有多種抗病、抗逆性狀，易與小麥雜交，且其優(yōu)良基因易于在小麥背景中表達(dá)，是小麥改良育種中重要的基因源。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已將偃麥草的許多有益基因轉(zhuǎn)移到小麥中[4-5]。

本研究以來(lái)源于中間偃麥草的八倍體小偃麥TAI7047為供體，以高感白粉病的優(yōu)質(zhì)小麥品種晉太170為受體，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育的方法，從其BC1F4后代群體中篩選出2個(gè)穩(wěn)定的抗白粉病株系CHadd 7001和CHadd 7002，并運(yùn)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、抗病性、基因組原位雜交的研究方法對(duì)其進(jìn)行了分析、鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括：從八倍體小偃麥TAI7047（2n=56）與普通小麥晉太170的BC1F4群體中選育出的2個(gè)穩(wěn)定株系CHadd 7001和CHadd 7002；二倍體擬鵝冠草（St基因組）；中國(guó)春。

1.2 方法

1.2.1 制片 在24℃恒溫箱中將種子培養(yǎng)至露白，4℃冰箱中處理24 h，再轉(zhuǎn)移到24℃恒溫箱中培養(yǎng)，待根長(zhǎng)1.5～2.0 cm時(shí)，剪取生長(zhǎng)健壯的根尖，冰水處理24 h，卡諾固定液I固定。檢測(cè)時(shí)，根尖用0.2mol/L鹽酸室溫解離8 h以上，45%醋酸壓片，相差顯微鏡下進(jìn)行觀察[6]。挑選中期分裂相多且分散好的片子，液氮冷凍揭片，氣干，置于干燥潔凈的載玻片貯藏盒中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組總DNA的提取 采用CTAB法[7]提取基因組DNA，略有改動(dòng)。

1.2.3 封阻DNA和探針DNA的制備 以普通小麥中國(guó)春的基因組DNA作為封阻DNA，以地高辛標(biāo)記的二倍體擬鵝冠草（St基因組）的基因組DNA作為探針DNA。

1.2.4 基因組原位雜交（GISH）

1.2.4.1 預(yù)處理 滴加100μL 70%的甲酰胺，80℃處理2min。依次放到-20℃預(yù)冷的不同梯度酒精中（70%，95%，100%）各5min。處理完將片子夾出，使其自然干燥。

1.2.4.2 配置雜交液 去離子甲酰胺7.5μL；20×SSC 1.5μL；ssDNA 1.5 μL；50%DS 3 μL；封阻DNA 1μL；Probe DNA 1μL。上述體系配置完成后，瞬時(shí)離心（閉光），然后80℃變性10min。變性完后，迅速放到冰上處理5min以上。

1.2.4.3 雜交 把1.2.4.2雜交液15μL滴加到載玻片上的染色體處，蓋上蓋玻片，然后在周?chē)可蠠o(wú)色指甲油保溫密封。放入濕潤(rùn)的盒子里37℃反應(yīng)8 h以上。用鑷子將指甲油剝掉，將標(biāo)本片浸入2×SSC染色缸中，輕輕搖動(dòng)使蓋片脫落，清洗20min，然后在1×PBS處理5min。離心管中加入0.5%小牛血清100μL，再加入0.5μL Antidigoxigenin Fab Fragments，渦旋混勻，滴加到蓋片上，蓋上蓋片，37℃條件下反應(yīng)45min。

1.2.4.4 清洗 將片子放入1×PBS中，輕搖使蓋玻片脫落，后用1×PBS清洗3次，每次5min。清洗好的片子在室溫下氣干，加上1滴含有1μg/mL Propidium iodide（PI）的抗褪色劑，蓋上蓋玻片。

1.2.4.5 鏡檢及照相 鏡檢在Leica DM RA2熒光顯微鏡下進(jìn)行，熒光信號(hào)分別采用藍(lán)色（B）激發(fā)濾光片組和綠色（G）激發(fā)濾光片組檢測(cè)。經(jīng)PI染色后，檢測(cè)到已標(biāo)記的探針雜交信號(hào)應(yīng)為黃色或黃綠色，其他染色體為橙紅色。圖像用Leica DFC 500采集。

2 結(jié)果與分析

本研究以普通小麥晉太170為受體親本，采用回交轉(zhuǎn)育法，以八倍體小偃麥TAI 7047作為轉(zhuǎn)移中間偃麥草基因組有益基因的橋梁材料，將中間偃麥草的抗白粉病基因?qū)肫胀ㄐ←溨小Ｍㄟ^(guò)對(duì)轉(zhuǎn)育的自交后代BC1F4進(jìn)行抗病性鑒定，從47個(gè)株系中篩選出2個(gè)對(duì)小麥白粉病免疫的株系CHadd 7001和CHadd 7002，說(shuō)明TAI7047所攜帶的中間偃麥草的抗病基因已成功導(dǎo)入普通小麥中。有絲分裂結(jié)果表明，這2個(gè)株系的染色體數(shù)目均為2n=44，因此可以初步判斷為2個(gè)小麥-中間偃麥草的抗白粉病異附加系[6]。

采用地高辛標(biāo)記的二倍體擬鵝冠草基因組DNA作探針、普通小麥中國(guó)春基因組DNA作封阻，進(jìn)行熒光原位雜交，GISH的結(jié)果表明，CHadd 7001和CHadd 7002株系中已分別成功導(dǎo)入1對(duì)中間偃麥草的染色體，即圖中檢測(cè)到探針雜交信號(hào)為黃色或黃綠色的染色體；而其他染色體上未檢測(cè)到雜交信號(hào)，呈橙紅色（圖1，2）。從圖1，2可以看出，雜交信號(hào)出現(xiàn)在染色體的不同位置。其中，CHadd 7001附加的外源染色體上，黃綠色的雜交信號(hào)出現(xiàn)在著絲點(diǎn)位置附近，由此可知，其所附加的外源染色體來(lái)自中間偃麥草的Js組染色體；而CHadd 7002附加的染色體雜交信號(hào)出現(xiàn)在兩臂的端部位置，由此可知，其所附加的外源染色體來(lái)自中間偃麥草的J組染色體[8]。根據(jù)根尖細(xì)胞有絲分裂核型分析、減數(shù)分裂結(jié)果、GISH帶型和雜交信號(hào)的分布，得出CHadd 7001和CHadd 7002為2個(gè)不同的小麥-中間偃麥草雙體異附加系。

3 討論

基因組原位雜交是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種以親本之一的總基因組DNA作探針，另一親本的基因組DNA作封阻的原位雜交技術(shù)。它可以有效分析遠(yuǎn)緣雜交后代染色體組的組成；系統(tǒng)研究多倍體中基因組之間的親緣關(guān)系、基因組的組成及起源；準(zhǔn)確鑒定附加系、代換系和易位系，并對(duì)其中外源染色體或染色體片段的來(lái)源、大小、數(shù)目及發(fā)生位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)和定位[9]。在應(yīng)用GISH檢測(cè)八倍體小偃麥及其衍生品系過(guò)程當(dāng)中，通常使用二倍體擬鵝冠草基因組DNA作探針，這種探針既與小麥基因組遠(yuǎn)同源，又能同時(shí)分辨出 JJsS（EeEbSt）3 個(gè)基因組[10-11]。

本研究從八倍體小偃麥TAI 7047與普通小麥的雜交后代中選育了2個(gè)小麥-中間偃麥草異附加系CHadd 7001與CHadd 7002，它們均來(lái)自1對(duì)親本的雜交后代，遺傳背景簡(jiǎn)單，在遺傳學(xué)研究中具有一定的利用價(jià)值。由于這2個(gè)附加系均免疫當(dāng)前我國(guó)流行的白粉病菌E09，E21，E26等生理小種，農(nóng)藝性狀接近小麥親本（親本晉太170農(nóng)藝性狀好，品質(zhì)優(yōu)良，生產(chǎn)上有較大推廣面積），因此，可以作為小麥抗病育種的新抗源，也可與普通小麥進(jìn)一步回交來(lái)創(chuàng)造抗病代換系和易位系。

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