李紅麗，詹麗娥，王彩先，唐 娟，陸冰洋

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

麻雞副黏病毒病是由雞新城疫病毒引起麻雞的一種高度接觸性傳染病。近年來(lái)，由于NDV強(qiáng)毒株和變異株的流行，使得傳統(tǒng)疫苗已不能控制其流行，構(gòu)建同源高效低毒的弱毒疫苗株，已成為迫切需要[1-2]。

本試驗(yàn)針對(duì)麻雞副黏病毒F蛋白的特點(diǎn)，定點(diǎn)突變麻雞副黏病毒ZH-1株F蛋白112，115，117位氨基酸密碼子，使突變后的F蛋白的裂解位點(diǎn)具有弱毒株的特點(diǎn)[3]，旨在為下一步通過(guò)反向遺傳技術(shù)構(gòu)建麻雞副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、受體菌

工程菌DH5α由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所預(yù)防獸醫(yī)研究室保存，重組質(zhì)粒pGF（麻雞副黏病毒ZH-1株F gene）由該研究室構(gòu)建。

1.2 酶與試劑

DNA Markers，LATaq酶，限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ，HindⅢ）購(gòu)自TaKaRa公司；DNA gel extraction Kit購(gòu)自vitagene公司。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)麻雞副黏病毒ZH-1株F基因序列[4]，采用PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)[5-7]，首先設(shè)計(jì)1對(duì)外側(cè)引物F1和F4，該對(duì)引物分別與模板DNA的5′末端、3′末端互補(bǔ)。然后再在突變處設(shè)計(jì)1對(duì)完全互補(bǔ)的引物F2和F3，互補(bǔ)處引物長(zhǎng)度為18 bp，設(shè)計(jì)原則是引物F2和F3有2個(gè)互補(bǔ)的、并在相同部位具有相同堿基突變的區(qū)域。使用這種重疊PCR定點(diǎn)突變法，需要進(jìn)行3輪PCR反應(yīng)。其中，前2輪擴(kuò)增形成2條有一端可彼此互補(bǔ)的雙鏈DNA片段，二者在其互補(bǔ)區(qū)段具有同樣的突變，第3輪PCR使這2條片段融合起來(lái)，形成完整的目的基因片段。突變引物為:

其中，F(xiàn)1和F4兩引物的5′端分別加上了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，由斜體表示；F2和F3兩引物互補(bǔ)處由下劃線(xiàn)標(biāo)注，突變堿基處由方框標(biāo)注。

1.4 PCR擴(kuò)增F變基因[8]

第1，2輪PCR以重組質(zhì)粒pGF為模板，以引物F1和F2擴(kuò)增F基因的前351堿基對(duì)區(qū)域，以引物F3和F4擴(kuò)增F基因的后1326堿基對(duì)區(qū)域；第3輪PCR以前2輪PCR純化回收的產(chǎn)物等量加入作為模板，用引物F1和F4進(jìn)行擴(kuò)增，得到裂解位點(diǎn)發(fā)生3個(gè)氨基酸密碼子突變的F變基因。反應(yīng)體系列于表1和表2。

表1 第1，2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

表2 第3輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min；94℃變性 45 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將3段PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收純化。

1.5 F基因克隆、序列測(cè)定及分析[9]

將電泳檢測(cè)正確的目的片段與pGEM-T載體以體積比5∶1進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α，篩選出陽(yáng)性克隆株，經(jīng)酶切、PCR鑒定，目的基因已克隆入pGEM-T載體，陽(yáng)性克隆菌株送上海生工生物工程公司測(cè)序。利用Blast及DNAStar軟件分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

將重組質(zhì)粒pGF分別由引物F1和F2，F(xiàn)3和F4，F(xiàn)1和F4經(jīng)過(guò)第 1，2，3輪 PCR反應(yīng)后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分別得到1條長(zhǎng)度為361，1336，1662 bp的基因帶，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果相符合（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pGEM-F變經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后電泳，出現(xiàn)1條長(zhǎng)約1.7 kb的基因帶和長(zhǎng)約3.0 kb的pGEM-T載體帶（圖2）。

2.3 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

酶切鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到F變基因的核苷酸序列。擴(kuò)增的F變基因核苷酸序列長(zhǎng)度為1662 bp，編碼553個(gè)氨基酸。擴(kuò)增的F變基因112，115，117位氨基酸密碼子均被突變，與弱毒株在該處的堿基序列相符，F(xiàn)變基因的其余堿基序列與F基因堿基序列相一致，即

3 討論

NDV屬于副黏病毒科成員，為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，基因組全長(zhǎng)達(dá)到15186 bp或15192 bp，共編碼6種蛋白:核衣殼蛋白（NP）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）、大蛋白（L）、磷蛋白（P）[10]。F蛋白是禽副黏病毒感染細(xì)胞所必需的，它可促進(jìn)病毒的囊膜與宿主細(xì)胞表面的脂蛋白膜融合[11]（又稱(chēng)融合蛋白），使病毒穿入細(xì)胞漿脫去核衣殼進(jìn)行復(fù)制。同時(shí)，F(xiàn)蛋白也是決定副黏病毒毒力的主要因素[12]。F蛋白首先合成無(wú)活性的F0前體形式，F(xiàn)0由蛋白酶水解為F1和一個(gè)較小的F2后，才能發(fā)揮F蛋白的融合作用。這種裂解取決于病毒毒株和宿主細(xì)胞的特性。裂解由宿主含有的蛋白酶完成，強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)兩側(cè)具有附加的堿性氨基酸，裂解可以由多種宿主蛋白酶完成，弱毒株裂解位點(diǎn)兩側(cè)不含有附加的堿性氨基酸，只能在含有類(lèi)似胰蛋白酶的部位復(fù)制，例如呼吸道和腸道。因此，強(qiáng)毒株的F蛋白能在多種宿主細(xì)胞內(nèi)裂解，使強(qiáng)毒株可在許多組織和器官中復(fù)制，對(duì)多種細(xì)胞具有感染力，導(dǎo)致致命的全身感染，而弱毒株的F蛋白只能在少數(shù)特殊類(lèi)型的細(xì)胞中裂解，只對(duì)少數(shù)細(xì)胞具有感染力（臨床上表現(xiàn)為局部感染）。

F基因裂解位點(diǎn)區(qū)的氨基酸組成是新城疫病毒致病力的分子基礎(chǔ)。F蛋白的裂解位點(diǎn)在122位和117位氨基酸之間，強(qiáng)毒株為112Arg-Arg-Gln-Arg/Lys-Arg-Phe117，在Gln兩側(cè)各有1對(duì)堿性氨基酸，這對(duì)F0的有效裂解具有重要作用。弱毒株以中性氨基酸取代了強(qiáng)毒株中的堿性氨基酸，特別是112位和115位堿性氨基酸被取代，F(xiàn)0更不易裂解，它以非活性形式編入子代病毒中，從而喪失了病毒囊膜與宿主細(xì)胞表面的脂蛋白膜融合的活性，感染性很低。117位的氨基酸也是影響裂解的主要因素，強(qiáng)毒株為Phe，弱毒株為L(zhǎng)eu；Phe雖不是裂解必需的，但轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)eu時(shí)卻能抑制裂解。

PCR反應(yīng)的出現(xiàn)推動(dòng)了定點(diǎn)突變的發(fā)展，以PCR為介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)為基因修飾、改造提供了一條重要途徑。通過(guò)改變引物中的某些堿基而改變基因序列，達(dá)到有目的地改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系的目的。重疊PCR延伸法是最經(jīng)典的PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù)[13-14]，該方法利用PCR技術(shù)在體外進(jìn)行有效基因重組和定點(diǎn)突變，且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理；該技術(shù)使用簡(jiǎn)便，利用其可快速獲得其他依靠?jī)?nèi)切酶方法難以得到的產(chǎn)物。

麻雞副黏病毒ZH-1株屬于基因Ⅸ型NDV，其F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)（112～117 aa）的氨基酸序列為112Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe117，與強(qiáng)毒株在這一區(qū)域的序列相符。同時(shí)，依據(jù)國(guó)際上判定新城疫病毒毒力的標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定該毒株的雞胚平均死亡時(shí)間（MDT），腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）和靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）分別為 69.6 h，1.66 和 1.65，雞胚最小致死量（MLD）為10-7，具有與新城疫病毒速發(fā)型相似的毒力，屬于強(qiáng)毒株。根據(jù)麻雞副黏病毒ZH-1株F蛋白與傳統(tǒng)新城疫弱毒株F蛋白的裂解特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了此試驗(yàn)對(duì)麻雞副黏病毒ZH-1株進(jìn)行F基因定點(diǎn)突變，使表達(dá)的F蛋白在裂解位點(diǎn)處氨基酸的組成具有弱毒株裂解位點(diǎn)的特點(diǎn)。由于改變的3個(gè)氨基酸并不是影響F蛋白結(jié)構(gòu)的主要因素，因此得到的F變基因編碼的蛋白與原F蛋白的抗原表位、疏水性、親水性以及糖基化幾乎完全保持一致。本研究為下一步構(gòu)建麻雞副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定了基礎(chǔ)。

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