王潔蓮

（山西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，山西 太原 030001）

民以食為天，食以安為先。蔬菜是人們生活中必不可少的輔助食物之一，其質(zhì)量安全直接關(guān)系著人們的身體健康。有機(jī)磷農(nóng)藥是病蟲(chóng)害防治常用藥物，在蔬菜上使用就可能有較多的農(nóng)藥殘留[1]。而蔬菜中農(nóng)藥殘留是衡量蔬菜質(zhì)量安全的重要指標(biāo)，其檢測(cè)技術(shù)有很多種，包括生物活體分析法、儀器分析法、酶抑制法等檢測(cè)手段。比較而言，生物活體分析法只對(duì)少數(shù)藥劑有反應(yīng)，無(wú)法辨別殘留農(nóng)藥的種類(lèi)，準(zhǔn)確性較低。儀器分析法檢測(cè)農(nóng)藥殘留是一種定性、定量分析法，分析結(jié)果準(zhǔn)確，但要求有專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員，技術(shù)難度高，儀器昂貴，分析樣品所需時(shí)間長(zhǎng)，要想及時(shí)掌握蔬菜質(zhì)量安全是不現(xiàn)實(shí)的。而酶抑制法可快速檢測(cè)蔬菜中的農(nóng)藥殘留，方法簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、成本低、易掌握等。

1 酶抑制法快速檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用現(xiàn)狀[2]

酶抑制快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)所測(cè)樣品的前處理要求簡(jiǎn)單，多數(shù)樣品可直接用于測(cè)試，在我國(guó)得到了較快的推廣應(yīng)用。目前，研制成功了100多種農(nóng)用藥物檢測(cè)試劑盒，其中常見(jiàn)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒有近30種。美國(guó)、加拿大、日本、巴西、印度等10多個(gè)國(guó)家，已將酶抑制法試劑盒或試紙條作為普查農(nóng)藥殘留和田間實(shí)地檢測(cè)的基本手段，許多公司專(zhuān)門(mén)從事檢測(cè)試劑盒或試紙條的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，幾乎所有重要農(nóng)藥品種都有殘留檢測(cè)試劑盒出售。酶抑制法快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的主流技術(shù)，也是現(xiàn)階段比較合理的選擇方案之一。

2 酶抑制法檢測(cè)技術(shù)介紹

2.1 酶抑制法檢測(cè)原理[3]

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥品種繁多，分子結(jié)構(gòu)各不相同，但它們的作用機(jī)理相同，都能抑制昆蟲(chóng)中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)使昆蟲(chóng)中毒死亡。如果蔬菜的提取液中含有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，則可抑制膽堿酯酶的活性，反之則不然。利用昆蟲(chóng)毒理學(xué)反應(yīng)的這種共性，在酶反應(yīng)試驗(yàn)中加入底物和顯色劑，通過(guò)觀察顏色的變化或測(cè)定酶與某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號(hào)的變化可判斷是否存在有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留。

2.2 酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的靈敏度與使用的酶、反應(yīng)時(shí)間、溫度等有密切關(guān)系

無(wú)論采用何種檢測(cè)方法，酶是其中決定檢測(cè)方法靈敏度和可靠性的最關(guān)鍵因子。酶對(duì)常用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的敏感度決定了方法的靈敏度，酶的種類(lèi)決定了方法的可靠性。目前，常用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶是膽堿酯酶，膽堿酯酶又分為丁酰膽堿酯酶和乙酰膽堿酯酶。膽堿酯酶的來(lái)源如表1所示。

表1 膽堿酯酶的來(lái)源[4]

3 檢測(cè)方法

依據(jù)酶抑制法原理設(shè)計(jì)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，主要有試紙法、比色法和膽堿酯酶生物傳感器法。

3.1 試紙法

將敏感生物（如馬、牛等）的膽堿酯酶和乙酰膽堿類(lèi)似物2，6-二氯靛酚乙酸酯分別經(jīng)固定化處理后加載到濾紙片上，靛酚乙酸酯在膽堿酯酶催化下迅速發(fā)生水解反應(yīng)，生成藍(lán)色的靛酚和乙酸，如果膽堿酯酶與有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥結(jié)合，便失去催化靛酚乙酸酯水解的能力，因此，在樣品中只要有微量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥存在，就能強(qiáng)烈地抑制藍(lán)色產(chǎn)物的生成，靠目測(cè)就可判斷農(nóng)藥殘留情況。即:藍(lán)色表示無(wú)農(nóng)藥殘留，淺藍(lán)色或白色表示有農(nóng)藥殘留。韓承輝等[5]從小麥中提取植物酶制作的試紙，可在5～10 min內(nèi)檢測(cè)蔬菜中常用的幾種有機(jī)磷農(nóng)藥。這些方法對(duì)常見(jiàn)農(nóng)藥的檢出限大都高于相應(yīng)農(nóng)藥的最大殘留限量，因此，它只能作為定性的快速初篩檢測(cè)法。該方法不需儀器，操作方便、快速，測(cè)試成本低，主要用于口岸、市場(chǎng)等蔬菜現(xiàn)場(chǎng)殘留檢測(cè)。

3.2 酶生物傳感器法

酶生物傳感器是一種將酶作為生物敏感部件與各種物理化學(xué)轉(zhuǎn)換器緊密配合，對(duì)特定種類(lèi)化學(xué)物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置[6]。生物敏感部件與特定分析物之間反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一些物理化學(xué)信號(hào)的變化，再通過(guò)轉(zhuǎn)移器轉(zhuǎn)化，放大后顯示或記錄下來(lái)。酶生物傳感器是近年來(lái)農(nóng)藥殘留研究最為活躍的領(lǐng)域。先后用丁酰膽堿酯酶[7]和乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)量有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，使酶抑制法的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性又有了很大提高，但現(xiàn)階段膽堿酯酶等生物材料在固定化過(guò)程中活性容易失去的問(wèn)題還沒(méi)有很好解決，影響了這一技術(shù)的推廣應(yīng)用。

3.3 比色法[8]

將蔬菜樣品殘留提取液與從敏感生物中提取的膽堿酯酶作用，以碘化硫代乙酰膽堿（ATCI）等為底物，二硫代-二硝基苯甲酸（DTNB）等為顯色劑，經(jīng)一定時(shí)間反應(yīng)后，利用農(nóng)藥殘留速測(cè)儀在410 nm波長(zhǎng)下比色，根據(jù)吸光值的變化計(jì)算膽堿酯酶的抑制率，從而判斷有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)。比色法具有靈敏度高及成本低等明顯優(yōu)勢(shì)，是目前使用的主要方法。市場(chǎng)上使用的酶主要是從敏感家蠅頭部提取純化的乙酰膽堿酯酶（AChE）和從動(dòng)物血清中提取的丁酰膽堿酯酶（BuChE），用丁酰膽堿酯酶檢測(cè)農(nóng)藥殘留存在著專(zhuān)一性和可靠性低、檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率高等問(wèn)題。以敏感家蠅頭部提取純化的乙酰膽堿酯酶為酶源的方法所需時(shí)間雖短，操作誤差小，但由于乙酰膽堿酯酶主要從家蠅等敏感昆蟲(chóng)頭部提取，產(chǎn)量低，成本高，所以，未能廣泛推廣。

4 酶抑制法檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在的問(wèn)題

酶抑制法檢測(cè)技術(shù)雖具有方便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但在使用過(guò)程中也存在一些亟待解決的問(wèn)題。

4.1 酶源的選擇[9]

動(dòng)物體內(nèi)的酯酶是十分復(fù)雜的類(lèi)群，如乙酰膽堿酯酶（AChE）、丁酰膽堿酯酶（BuChE）等，不同酯酶對(duì)農(nóng)藥的反應(yīng)大不相同。如馬血清中丁酰膽堿酯酶對(duì)異六甲磷的抑制率比乙酰膽堿酯酶高11300倍，而對(duì)丙胺氧磷的抑制率卻高達(dá)4200倍。在昆蟲(chóng)體內(nèi)AChE的異構(gòu)體有10多種，不同異構(gòu)體對(duì)農(nóng)藥反應(yīng)也千差萬(wàn)別。據(jù)研究，蒼蠅體內(nèi)頭部、胸部的AChE異構(gòu)體對(duì)農(nóng)藥的反應(yīng)截然不同，用對(duì)氧磷分別點(diǎn)滴頭、胸部發(fā)現(xiàn)，頭部AChE不受抑制，而胸部的AChE則非常敏感。同樣，胸部3種不同異構(gòu)體對(duì)馬拉硫磷反應(yīng)也相差好多倍；不同昆蟲(chóng)、不同抗藥性種群中的AChE對(duì)農(nóng)藥反應(yīng)更是南轅北轍。因此，敏感酶源的選擇與提取是檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，同一批次樣品必須選用同一批次酶源。

4.2 酶促條件[10]

酶是一種特異性的蛋白質(zhì)，酶促反應(yīng)要求十分嚴(yán)格，溫度、酸堿度、氧化還原電位是左右酶促反應(yīng)的重要條件。另外，酶的固定與貯存、酶的濃度、反應(yīng)底物劑量、顯色劑的選配及穩(wěn)定等等都會(huì)影響測(cè)試結(jié)果，而這些條件的控制與掌握，不是一般速測(cè)環(huán)境所能確保的，所以測(cè)試結(jié)果就難有重現(xiàn)性，也會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。

4.3 某些農(nóng)產(chǎn)品種類(lèi)不能檢測(cè)或有影響

如芹菜、韭菜、洋蔥等有刺激味的蔬菜樣品含有過(guò)多的葉綠素、花青素、植物次生物質(zhì)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有干擾作用，造成檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性。樣品提取液的pH值對(duì)膽堿酯酶的活性有影響，如農(nóng)藥速測(cè)卡使用的最佳pH值為7.5，若樣液的pH值偏離太大就會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。另外，反應(yīng)過(guò)程中的時(shí)間、溫度等均對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。

4.4 酶抑制法測(cè)定農(nóng)藥種類(lèi)有限[11]

目前，主要用于蔬菜、水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶抑制法，不能檢測(cè)其他類(lèi)型的農(nóng)藥，且不能給出定性和定量結(jié)果，最低檢出濃度偏高，導(dǎo)致某些農(nóng)藥品種的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，因此，其只能用于市場(chǎng)上對(duì)蔬菜的初篩。當(dāng)檢測(cè)到有農(nóng)藥殘留的蔬菜時(shí)，還需用色譜儀器進(jìn)行定性定量分析，方能作出最終結(jié)論。

5 前景與展望

國(guó)內(nèi)外實(shí)踐證明[12]，酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留技術(shù)是控制有毒蔬菜產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)和餐桌的有效手段。當(dāng)前，蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)已達(dá)到了一定的水平，氣相色譜、高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等也有了很大的發(fā)展，酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法可作為儀器分析方法的有益補(bǔ)充，針對(duì)市場(chǎng)、農(nóng)場(chǎng)蔬菜中農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，再用精密的色譜分析法確定陽(yáng)性或可疑樣品，可保證上市蔬菜的安全性，達(dá)到全面監(jiān)控農(nóng)藥殘留的目的。

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