馬 穎,何援利

（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣州510280）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis,EMs）是育齡期婦女的多發(fā)病,主要表現(xiàn)為痛經(jīng)及不孕,危害嚴(yán)重。EMs雖是一種良性病,卻具有易增生、浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)的惡性特點(diǎn),目前治療效果有限[1-2]。有研究提示EMs與血管生成關(guān)系密切,抑制血管生成可以達(dá)到抑制病灶生長(zhǎng)的目的。內(nèi)皮抑素（endostatin,ES）是一種強(qiáng)效的抗血管生成物質(zhì),可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,但ES蛋白不穩(wěn)定,需借助基因治療發(fā)揮作用[3-4]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）可抑制ES誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為探討血管生成在EMs中的作用,本研究構(gòu)建了攜帶ES基因的重組腺病毒,體外感染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304并誘導(dǎo)其凋亡,同時(shí)觀察VEGF對(duì)這一現(xiàn)象的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Pshuttle-ES質(zhì)粒由本科保存。大腸桿菌BJ5183、AAV293細(xì)胞株、ECV-304細(xì)胞由中山大學(xué)生命科學(xué)院提供。腺病毒AdEasy-1系統(tǒng),包括骨架質(zhì)粒pAdEasy-1及穿梭質(zhì)粒pAdT rack-CMV。限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ為NEB公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Sigma公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑、DNA膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒、LipofectAMINE2000、DM EM培養(yǎng)基、RPM I-1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、T4DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XbaⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品；鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體為Oncogene公司產(chǎn)品、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為中北京山生物工程公司產(chǎn)品。DNA序列測(cè)定由中山大學(xué)生命科學(xué)院測(cè)序中心完成。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒Ad-ES的構(gòu)建、包裝、純化、滴度及感染效率測(cè)定 以Pshuttle-ES質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增出ES片斷（約650bp）,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-ES,在大腸桿菌BJ5183中構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ES。同法,制備出無(wú)外源基因插入的空載質(zhì)粒pAd-T rack。pAd-ES轉(zhuǎn)染85%～90%融合的AAV293細(xì)胞,約14d后收集細(xì)胞,-80℃、37℃反復(fù)凍融,收集腺病毒Ad-ES,經(jīng)用氯化銫密度梯度離心純化。終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度（Titer）。同法得到空載腺病毒Ad-Track。以1×104密度接種ECV-304于6孔板,用感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）分別為1、10、100的Ad-ES感染,48h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白（GFP）陽(yáng)性細(xì)胞百分率,測(cè)定病毒的感染效率。

1.2.2 RT-PCR及Western blot檢測(cè)ES的轉(zhuǎn)錄和表達(dá) Ad-ES（MOI=100）感染85%～90%融合的ECV-304,72h后收集細(xì)胞,用Trizol試劑盒抽提總RNA,加入無(wú)RNase的DNaseⅠ37℃孵育10min后,于70℃滅活15min。用獲得的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,取2μ L cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行ES基因的PCR擴(kuò)增。同樣將感染的細(xì)胞沉淀經(jīng) SDS-PAGE電泳及 Western blot檢測(cè)；Ⅰ抗為鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體（1∶50）,Ⅱ抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶100）,DAB法顯色。

1.2.3 VEGF對(duì)ES誘導(dǎo)的ECV-304凋亡的抑制作用測(cè)定分組：（1）實(shí)驗(yàn)組為Ad-ES+VEGF（10ng/mL）組；（2）陰性對(duì)照組為Ad-ES組；（3）空白對(duì)照組為Ad-Track組。各組細(xì)胞感染72h后,用胰酶處理得到單細(xì)胞懸液。加入200μ L的RNase酶（1g/L）,37℃水浴30min,再加入800μ L的PI染色液4℃避光放置30min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的特征性亞二倍體峰。各組細(xì)胞感染72h后加入Hochest 33258染液（7.5μ g/mL）避光染色15～20min；再用-20℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次,棄上清液,熒光顯微鏡觀察核染色及凋亡小體的情況。10%甲醛（formalin）固定細(xì)胞20min,加入0.1g/L結(jié)晶紫染液染色30min,用10%冰醋酸2mL抽提,抽提液與雙蒸水混勻,在酶標(biāo)儀上讀取590nm處吸光度值,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Dunnett t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒Ad-ES的包裝過(guò)程 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-ES轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞16h后,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá),熒光逐漸增多增亮,轉(zhuǎn)染后5～9d,細(xì)胞膨脹變圓,觸角逐漸消失,熒光不再增加,部分細(xì)胞開(kāi)始懸浮,呈串珠樣改變,表明病毒的形成和擴(kuò)增；約在轉(zhuǎn)染后14d,大部分AAV293細(xì)胞胞體固縮、懸浮,見(jiàn)封3圖1～4。

2.2 ES的轉(zhuǎn)錄和表達(dá) Ad-ES感染的ECV-304細(xì)胞有ES片段的擴(kuò)增,而空白對(duì)照組無(wú)特異性條帶產(chǎn)生,表明插入的ES基因在mRNA水平能有效轉(zhuǎn)錄,見(jiàn)圖5。以MOI=100的Ad-ES感染ECV-304,約20kD處有特異性條帶,與ES蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致,證明Ad-ES在ECV-304中有效地的表達(dá),見(jiàn)圖6。

圖5 RT-PCR檢測(cè)ES在ECV-304細(xì)胞中的表達(dá)

圖6 Western blot檢測(cè)ES蛋白的表達(dá)

圖7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

圖9 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況 Ad-ES感染ECV-304細(xì)胞72h后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征性的亞二倍體峰,Ad-ES+VEGF組細(xì)胞凋亡減少,Ad-Track組未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖7。Ad-ES感染ECV-304細(xì)胞72h后出現(xiàn)大量的凋亡小體,Ad-ES+VEGF組凋亡較少,Ad-Track組無(wú)明顯凋亡,見(jiàn)封4圖8。

2.4 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 繪制不同處理時(shí)間的各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,Ad-ES組細(xì)胞增殖速度明顯低于Ad-Track組和Ad-ES +VEGF組,而后兩組細(xì)胞增殖速率相似,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見(jiàn)圖9。

3 討論

EMs是一種危害嚴(yán)重、治療困難的多發(fā)病,其發(fā)病機(jī)制不明。多項(xiàng)研究提示,新生血管生成是異位內(nèi)膜病灶存在與發(fā)展的前提,抗血管生成治療有望成為治療EMs的有效途徑之一。

ES是一種強(qiáng)效的抗血管生成物,可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并抑制其遷移,但ES蛋白不穩(wěn)定,必須借助基因治療發(fā)揮作用?；蛑委煹年P(guān)鍵環(huán)節(jié)就是選擇高效安全的基因載體,本研究采用的腺病毒AdEasy-1系統(tǒng)是一種高效安全的基因載體,其安全、遺傳毒性低,控制轉(zhuǎn)錄復(fù)制單位E1基因和編碼毒性產(chǎn)物E3基因已被剔除,故不會(huì)自身復(fù)制；感染率高,易繁殖,宿主廣泛；不整合到宿主細(xì)胞的染色體中,因而不會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[5-7]。VEGF具有強(qiáng)大的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促血管生成作用,可對(duì)抗ES誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。多項(xiàng)研究提示VEGF的過(guò)表達(dá)可能是導(dǎo)致EMs發(fā)生的重要因素[8]。

在本研究中,成功構(gòu)建并在AAV293細(xì)胞中包裝出攜帶ES基因的重組腺病毒Ad-ES,感染ECV-304細(xì)胞后,用RTPCR及Western blot檢測(cè)到ES的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)Ad-ES感染后的ECV-304細(xì)胞增殖速度明顯下降并出現(xiàn)凋亡,如果同時(shí)加入VEGF,則細(xì)胞凋亡明顯減少。提示ES能夠改變ECV-304細(xì)胞的生物活性,使其凋亡增加,這可能是ES抑制血管生成的重要機(jī)制之一；而上述作用能夠被VEGF所對(duì)抗,從另一個(gè)方面說(shuō)明ECV-304細(xì)胞受ES影響而發(fā)生變化,為進(jìn)一步研究EM s血管生成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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