鄭傳東,茍 欣,胡興平,張 力,鄧 林

（1.四川省成都市第五人民醫(yī)院泌尿外科 611130；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科 400016）

雷帕霉素（rapamycin,RPM）又名西羅莫司是20世紀(jì)70年代初,由加拿大Ayerst研究所從放線菌培養(yǎng)液中分離出來(lái)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近年來(lái)研究證明它是一種強(qiáng)有力的免疫抑制劑,其免疫作用較環(huán)孢素A強(qiáng)100倍左右,并已廣泛應(yīng)用于腎移植中。腎缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎小管壞死和腎移植失敗的重要因素。越來(lái)越多的研究表明,腎缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注致腎損害的重要環(huán)節(jié)之一[1]。因此,抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生對(duì)腎缺血再灌注損傷的防治具有重要的臨床意義。有資料表明RPM能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Fas和Bcl-2（B-cell lymphoma-2）是重要的凋亡相關(guān)基因[1]。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠腎缺血再灌注損傷模型,研究RPM對(duì)大鼠缺血再灌注腎Fas、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響以及對(duì)再灌注24h的腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響,探討RPM對(duì)腎缺血再灌注的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)藥物與試劑 RPM由中國(guó)華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供,批準(zhǔn)文號(hào)：2002HL0259,口服液,規(guī)格1mg/mL。兔多抗Fas由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供,兔多抗Bcl-2、即用型SABC法免疫組化試劑盒SA1022、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 54只Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量200～250g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成假手術(shù)組（sham）、手術(shù)組（IR）和藥物組（RPM+IR）。手術(shù)組和藥物組又按缺血再灌注時(shí)間分為再灌注后0、24、48、72h等4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)6只。

1.3 動(dòng)物模型的建立與用藥 參照以往方法建立腎缺血再灌注損傷模型[2-3],10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射,麻醉后作腹部正中切口,切除右側(cè)腎,分離左腎動(dòng)脈,保護(hù)好輸尿管,靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈。腎臟顏色發(fā)白即可確認(rèn)腎臟血流阻斷。假手術(shù)組分離左腎動(dòng)脈后不阻斷血流,進(jìn)行兩次開(kāi)腹,其間隔時(shí)間約45min。假手術(shù)組、手術(shù)組于術(shù)前灌胃給予等量生理鹽水,以做陰性對(duì)照。藥物組于術(shù)前灌胃給藥RPM 3d,劑量為4mg·kg-1·d-1,并于術(shù)前2h灌胃,術(shù)后給藥至各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)。腹腔內(nèi)保留林格液20mL/kg,關(guān)閉腹腔。缺血45min后,再次打開(kāi)腹腔,顯露腎臟,松開(kāi)動(dòng)脈夾,腎臟由蒼白變?yōu)榧t潤(rùn)可確認(rèn)腎臟血流恢復(fù),縫合切口。分別再灌注0、24、48、72h,即為本試驗(yàn)的腎缺血再灌注損傷模型。

1.4 HE染色的組織學(xué)檢查 取上述動(dòng)物模型腎組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成3μ m厚的切片,HE染色,用普通光鏡觀察各組腎臟組織病理學(xué)變化情況。

1.5 再灌注24h的腎組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取再灌注24h大鼠左腎迅速固定于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中備用,送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室行透射電鏡（EM,日立H-7500）檢查,觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 免疫組化檢測(cè)Fas和 Bcl-2的表達(dá) 取上述石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。嚴(yán)格按SABC法免疫組化試劑盒操作,每張切片隨機(jī)采集10個(gè)無(wú)重疊高倍視野（×400）,輸入醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理。檢測(cè)Fas、Bcl-2表達(dá)的平均光密度值,并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù),計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率（positive index,PI）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)× 100%,所有視野均在同一光強(qiáng)度下檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均以±s表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎缺血再灌注后各組腎組織形態(tài)學(xué)改變 肉眼見(jiàn)：手術(shù)組腎皮質(zhì)、髓質(zhì)嚴(yán)重淤血、水腫；藥物組髓質(zhì)可見(jiàn)輕度淤血和水腫；假手術(shù)組未見(jiàn)異常。光鏡下：手術(shù)組隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),腎組織發(fā)生不同的病理改變。0h：腎小球和腎小管均未見(jiàn)明顯病變。24h：腎小管輪廓清晰,大片腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡樣,壞死脫落明顯,基底膜僅剩輪廓,腎小管中可見(jiàn)大量死亡脫落細(xì)胞殘留物質(zhì)。48h：腎小管開(kāi)始出現(xiàn)修復(fù)現(xiàn)象,腎小管中殘留物減少。72h：大部分腎小管結(jié)構(gòu)已基本恢復(fù),管腔內(nèi)容物基本清除。光鏡下,藥物組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病變較手術(shù)組明顯減輕,腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡樣、顆粒樣變性輕微,無(wú)明顯壞死,間質(zhì)無(wú)明顯異常（圖1、2）。假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常。各組染色后腎小球均未見(jiàn)明顯的病理改變。

圖1 手術(shù)組再灌注后24h時(shí)腎組織形態(tài)學(xué)改變（HE×400）

圖2 藥物組再灌注后24h時(shí)腎組織形態(tài)學(xué)改變（HE×400）

2.2 腎缺血再灌注24h的腎組織超微結(jié)構(gòu)變化 假手術(shù)組：腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常。手術(shù)組：近曲小管管腔被大量壞死脫落的上皮細(xì)胞、線粒體等細(xì)胞碎片堵塞,近曲小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴堆積。藥物組：腎小管近曲小管管腔內(nèi)有少許細(xì)胞脫落物質(zhì),上皮細(xì)胞整體正常,細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體正常,無(wú)明顯腫脹,僅有少許深色的溶酶體輕度腫脹（圖3、4）。

2.3 腎缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)腎組織Fas和Bcl-2的表達(dá)

2.3.1 RPM對(duì)Fas蛋白表達(dá)的影響 Fas陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,細(xì)胞核無(wú)著色。陽(yáng)性表達(dá)位于腎小管上皮細(xì)胞,腎皮質(zhì)處最明顯,腎小球未見(jiàn)表達(dá)（圖5、6）。假手術(shù)組只有少數(shù)細(xì)胞呈陰性表達(dá)；手術(shù)組與假手術(shù)組比較,Fas表達(dá)明顯增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；藥物組與手術(shù)組比較,Fas表達(dá)強(qiáng)度顯著減弱,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）,見(jiàn)表1。

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)Bc1-2、Fas蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較±s,%,n=6）

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)Bc1-2、Fas蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較±s,%,n=6）

*：P＜0.05,與假手術(shù)組比較；#：P＜0.05,與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組比較。

組別 Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率 Fas陽(yáng)性表達(dá)率Sham組 1.27±0.12 1.19±0.07手術(shù)組0h 6.13±3.94* 7.95±3.68*24h 36.51±11.25* 30.93±9.02*48h 43.89±16.05* 40.18±11.63*72h 31.75±9.89* 51.96±17.04*藥物組0h 11.45±5.79# 2.85±0.16#24h 49.91±15.32# 13.62±4.71#48h 61.35±17.99# 19.29±6.04#72h 49.67±11.57# 27.14±8.35#

圖3 手術(shù)組再灌注后24h時(shí)腎組織超微結(jié)構(gòu)變化（EM×5000）

圖4 藥物組再灌注后24h時(shí)腎組織超微結(jié)構(gòu)變化（EM×5000）

圖5 手術(shù)組再灌注后72h時(shí)Fas在腎組織的表達(dá)（SABC×400）

圖6 藥物組再灌注后72h時(shí)Fas在腎組織的表達(dá)（SABC×400）

圖7 手術(shù)組再灌注后48h時(shí)Bcl-2在腎組織的表達(dá)（SABC×400）

圖8 藥物組再灌注后48h時(shí)Bcl-2在腎組織的表達(dá)（SABC×400）

2.3.2 RPM對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,細(xì)胞核無(wú)著色。陽(yáng)性表達(dá)位于腎小管上皮細(xì)胞,腎皮質(zhì)處最明顯,腎小球未見(jiàn)表達(dá)（圖7、8）。假手術(shù)組只有少數(shù)細(xì)胞弱陽(yáng)性表達(dá)；手術(shù)組與假手術(shù)組比較,Bcl-2表達(dá)增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；藥物組與手術(shù)組比較,Bcl-2表達(dá)顯著增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）,見(jiàn)表1。

3 討論

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腎臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致了腎小管上皮細(xì)胞凋亡[4],對(duì)移植后的尸體腎活檢,同樣發(fā)現(xiàn)了腎小管上皮細(xì)胞凋亡[5]。腎小管細(xì)胞培養(yǎng)模型的研究進(jìn)一步證實(shí)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和異體移植腎的研究結(jié)果,使培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞的ATP部分缺失或處于缺氧培養(yǎng)環(huán)境,模擬腎臟缺血性損傷,可見(jiàn)腎小管細(xì)胞凋亡增加,同時(shí)細(xì)胞壞死也更嚴(yán)重。

3.1 Fas參與腎缺血再灌注損傷 細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因素有自然狀態(tài)下的程序性死亡和病理狀態(tài)下的生存信號(hào)丟失、DNA損傷、受體介導(dǎo)等。受體介導(dǎo)途徑中,Fas/FasL系統(tǒng)最具代表性[6]。Fas為Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NGFR）/腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員。Fas細(xì)胞外部分可與抗Fas單克隆抗體或Fas配體（FasL）特異性結(jié)合,經(jīng)死亡域傳導(dǎo)死亡信號(hào),可促發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)事件,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。Fas及FasL是誘發(fā)腎臟多種細(xì)胞發(fā)生凋亡的蛋白。以往認(rèn)為,FasL只存在于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞表面,目前發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞有FasL表達(dá),說(shuō)明在腎臟細(xì)胞中存在Fas/FasL系統(tǒng)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物組與手術(shù)組比較,Fas表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.05）,提示RPM具有抑制Fas表達(dá)的作用,可抑制細(xì)胞凋亡。

3.2 Bcl-2參與腎缺血再灌注損傷 Bcl-2是研究最早抗凋亡基因之一,在缺血再灌注損傷中表現(xiàn)得尤為突出[9]。Bcl-2抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與以下幾方面有關(guān)：（1）抑制Ca2+的釋放；（2）Bcl-2通過(guò)阻止促細(xì)胞凋亡基因信號(hào)傳遞或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物發(fā)揮作用；（3）抑制細(xì)胞色素C的釋放,產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用；（4）Bcl-2抗Fas凋亡的特性[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物組與手術(shù)組比較,Bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）,提示RPM具有促進(jìn)Bcl-2表達(dá)的作用,可抑制細(xì)胞凋亡。

3.3 RPM腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制 RPM分子式為C51H79NO13,其相對(duì)分子質(zhì)量為914.2,在結(jié)構(gòu)上與另一種免疫抑制藥FK506極為相似,二者均屬大環(huán)內(nèi)酯類,但RPM具有與FK506不同的作用機(jī)制。FK506為與環(huán)孢素（CsA）作用機(jī)制相似的鈣調(diào)神經(jīng)素抑制劑（CNI）類免疫抑制劑,而RPM為具有不同作用機(jī)制的增殖信號(hào)抑制劑（Proliferation signal inhibitors,PSI）類免疫抑制劑[11]。有研究發(fā)現(xiàn)RPM 可能通過(guò)非直接通路使激活的T細(xì)胞凋亡,阻止了樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的抗原呈遞,并抑制其成熟,減少細(xì)胞因子的分泌[12-13]。阻止DC在腎組織遷移聚集,可以明顯減輕大鼠缺血再灌注腎組織的病理?yè)p傷及改善腎功能[14]。RPM不僅局限于對(duì)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生作用,它亦能抑制平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等增殖[15]。

RPM對(duì)大鼠急性腎缺血再灌注損傷保護(hù)作用的確切機(jī)制還不清楚。其作用機(jī)制可能是：（1）通過(guò)抑制 T細(xì)胞、T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的活性,減少細(xì)胞因子的分泌,抑制炎癥,減少自由基的生成；（2）抑制平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等增殖,改善腎臟微循環(huán)；（3）從抑制細(xì)胞凋亡等多種途徑減輕腎組織損傷。RPM已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床器官移植中抗急、慢性排斥反應(yīng),預(yù)防心血管內(nèi)再狹窄,以及抗腫瘤、抗病毒等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RPM也對(duì)大鼠缺血再灌注腎有明確的保護(hù)作用。RPM可能通過(guò)下調(diào)Fas、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平而減輕腎缺血再灌注損傷,該藥物是探索臨床預(yù)防和減輕腎缺血再灌注損傷的有效方法之一。

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