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生物芯片技術(shù)是上世紀(jì)末生命科學(xué)領(lǐng)域取得的最大科學(xué)技術(shù)進(jìn)展之一，是將各種生物信息分子如寡核苷酸、基因片段、cDNA片段或多肽、蛋白質(zhì)等按預(yù)先設(shè)置的排列高密度固定在固相支持介質(zhì)上行成微陣列，利用生物分子的特異性親和反應(yīng)，如核酸雜交反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)等進(jìn)行各種定性、定量分析的一種技術(shù)。其連續(xù)化、集成化、自動(dòng)化，高通量的特點(diǎn)為后基因組時(shí)代基因功能研究、新藥研發(fā)及疾病早期診斷、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后評(píng)估等提供了強(qiáng)有力的分析工具。自誕生以來，生物芯片技術(shù)發(fā)展迅猛，目前已經(jīng)形成了全球年產(chǎn)值達(dá)近百億美元的銷售市場，具有明顯的高科技產(chǎn)業(yè)化前景。肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，目前已成為所有癌癥中遞增速度最快的惡性疾病[1]。近年來，盡管肺癌綜合治療技術(shù)有了很大進(jìn)步，但肺癌長期生存率仍只有10%-15%[1]。主要原因是肺癌起病隱匿，現(xiàn)階段仍缺乏有效的篩查和早期診斷方法。目前已證實(shí)肺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因共同參與、多途徑相互影響的復(fù)雜生物學(xué)進(jìn)程，與多種癌基因、抑癌基因、DNA修復(fù)基因等變異或表達(dá)異常有關(guān)[2]。如何跳出過去僅僅局限于單基因的腫瘤分子學(xué)研究禁錮，從海量數(shù)據(jù)中尋找肺癌的發(fā)病因素和癌變多階段演進(jìn)的分子機(jī)制，是目前科研和臨床工作者必須面對(duì)的問題。生物芯片技術(shù)的誕生克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量等不足，為人們提供了一種全新的思維方式和微系統(tǒng)形式加速揭開癌癥的分子生物學(xué)奧秘[3]。本文將討論生物芯片技術(shù)在肺癌中的最新研究進(jìn)展。

1 生物芯片分類及應(yīng)用

生物芯片可分為基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等。世界上第一塊生物芯片即美國Affymatrix公司研制的基因芯片。該公司的研發(fā)人員于1992年運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，對(duì)原位合成制備的DNA芯片作了首次報(bào)道。隨著化學(xué)染料、微電子技術(shù)、激光、數(shù)據(jù)分析技術(shù)的更新，目前基因芯片技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，其應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大?；诨蛐酒谋容^基因組雜交技術(shù)（comparative genome hybridization, CGH）在保留了CGH技術(shù)樣本量要求低、全基因組快速掃描等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，解決了其敏感性差、自動(dòng)化程度低、操作復(fù)雜等技術(shù)問題，成為支持研究人員通過基因芯片技術(shù)準(zhǔn)確研究與疾病有關(guān)的染色體變化的嶄新平臺(tái)。Bro?t等[4]運(yùn)用該技術(shù)對(duì)85例Ib期肺腺癌組織進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)56.5%的病例存在染色體5p的擴(kuò)增，與此對(duì)應(yīng)的是此區(qū)域端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因（telomerase reverse transcriptase,TERT）和泛素連接酶基因（S-phase kinase associated protein 2, SKP2）的大量擴(kuò)增事件。此外，8q24（c-MYC）、11q13（CCND1）及14q13（TTF1）區(qū)域也發(fā)生了節(jié)段性擴(kuò)增。這些變化與患者是否存在腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)，作者認(rèn)為分析肺癌染色體變化特征對(duì)于預(yù)測早期肺癌的預(yù)后大有幫助。國內(nèi)雖然在基因芯片技術(shù)開發(fā)上起步較晚，但目前也具有地中海貧血、肺結(jié)核桿菌及其耐藥性、乙肝等疾病的檢測芯片專利。因?yàn)樯矬w的眾多功能最終都要通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，故在活性基因所表達(dá)的mRNA與蛋白質(zhì)之間未能顯示出直接關(guān)系的前提下，基因芯片技術(shù)的應(yīng)用必然會(huì)受到一定的限制，蛋白芯片技術(shù)也就隨之應(yīng)運(yùn)而生。蛋白芯片基本原理類似于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，即利用抗原抗體結(jié)合的特異性來檢測受檢標(biāo)本內(nèi)的抗原或抗體。通過報(bào)告分子如熒光標(biāo)記的位置、熒光強(qiáng)弱等信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)的生物信息[5]。如多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)可以對(duì)多種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，從而解決了在臨床診斷領(lǐng)域一直困擾人們的難題-如何快速而有效地早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間-質(zhì)譜（surface enhanced laserdesorp-tion/ionizationtime of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）技術(shù)，可使吸附在蛋白芯片上的靶蛋白離子化，在電場力的作用下計(jì)算出其質(zhì)量電荷比，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫配合使用，可檢測到經(jīng)典方法無法測定的低豐度蛋白質(zhì)。Au等[6]利用該技術(shù)從21例無吸煙史的肺癌患者組織中篩選出與癌旁正常組織完全不同的新的痕量蛋白標(biāo)記物，其進(jìn)一步的純化和確定將為無吸煙史肺癌的診斷和靶向治療提供新的途徑。在目前提倡腫瘤個(gè)體化治療的背景下，蛋白芯片技術(shù)在新輔助化療敏感與耐藥差異蛋白篩查中也具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[7]。細(xì)胞芯片和組織芯片技術(shù)是近年來基因芯片技術(shù)的發(fā)展和延伸。細(xì)胞芯片可以建立活體的多相反應(yīng)體系，克服了基因、蛋白芯片僅僅檢測生物信息分子是否表達(dá)或表達(dá)量高低，而無法評(píng)估生命最基本單位-細(xì)胞整體功能的缺陷[8]。在新型藥物研發(fā)過程中，利用細(xì)胞芯片上的靶細(xì)胞篩選藥物，不僅可以提高藥物開發(fā)的效率，而且可以實(shí)現(xiàn)藥物篩選的敏感性、高通量和自動(dòng)化集成。北京-生物芯片國家工程研究中心利用實(shí)時(shí)細(xì)胞阻抗傳感技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞芯片上對(duì)細(xì)胞遷移過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測，為生物體胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤轉(zhuǎn)移等眾多生物過程提供了獨(dú)特而巧妙的檢測方法[9]。組織芯片則具有將分子生物學(xué)和組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合的優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)組織分析研究的瓶頸。結(jié)合免疫組織化學(xué)、原位雜交、原位PCR等技術(shù)，可以在基因、蛋白、細(xì)胞等不同水平進(jìn)行形態(tài)與功能的研究[10,11]。Fernandes等[12]利用組織芯片技術(shù)在觀察到硫氧還蛋白家族蛋白在不同分化程度的肺癌組織中的差異表達(dá)后，闡明了硫氧還蛋白家族蛋白表達(dá)與肺癌腫瘤細(xì)胞增殖與分化之間的關(guān)系，從而為肺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的分子學(xué)基礎(chǔ)。陳洪雷等[13]以組織芯片為載體，利用量子點(diǎn)技術(shù)檢測Cav-1、CD147、MMP-2在人肺癌組織中的表達(dá)。不僅建立了有效的高通量蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)，還證實(shí)Cav-1在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。

2 肺癌機(jī)制研究

腫瘤的形成都伴隨著DNA甲基化和組蛋白的修飾異常，其中異常甲基化包括基因組的低甲基化（hypomethylation）和抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高度甲基化（hypermethylation）。因檢測手段的效率低下，過去人們對(duì)DNA甲基化在癌癥致病中的認(rèn)識(shí)十分有限。Rauch等[14]近期發(fā)明了一種基于MBD2b/MBD3L1蛋白復(fù)合物對(duì)甲基化CpG二核苷酸高親和力的甲基化高分辨率檢測方法——MIRA，在以微矩陣形式實(shí)現(xiàn)其高通量檢測后可以評(píng)估全基因組甲基化。研究者著重探討了HOX基因甲基化與肺癌發(fā)病之間的關(guān)系。通過對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和正常人支氣管上皮NHBE細(xì)胞的大規(guī)?；蚪M掃描，將分別位于染色體2、7、12和17的HOXA、HOXB、HOXC和HOXD基因簇進(jìn)行了甲基化分析。結(jié)果提示旁系同源基因HOXA6、HOXB6啟動(dòng)子在A549細(xì)胞中發(fā)生高度甲基化，而在NHBE細(xì)胞中則無甲基化現(xiàn)象。在進(jìn)一步的I期原發(fā)肺癌組織中的檢測表明，肺腺癌和肺鱗癌有不同的HOX基因甲基化譜，后者具有較少程度的HOX基因甲基化現(xiàn)象，但HOXA9與I期肺鱗癌的發(fā)病高度相關(guān)，具有較好的早期診斷價(jià)值。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）家族參與多種實(shí)體瘤的發(fā)生與發(fā)展，是抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）中，EGFR突變與其磷酸化事件在NSCLC發(fā)病中的具體信號(hào)機(jī)制尚未闡明。VanMeter等[15]采用反向蛋白芯片（reverse phase protein microarray,RPPM）技術(shù)，結(jié)合激光捕獲顯微切割方法，觀察25例NSCLC患者腫瘤組織微環(huán)境中EGFR家族酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變與其自身和下游信號(hào)分子的磷酸化事件。在所研究的6個(gè)磷酸化位點(diǎn)中，所有EGFR突變型患者腫瘤組織中的Tyr-1148、Tyr-1068磷酸化明顯增多，而Tyr-1045、HER2 Tyr-1248、IRS-1 Ser-612以及SMAD Ser-465/467磷酸化則顯著減少。研究者在體外EGFR突變型NSCLC細(xì)胞系的類比實(shí)驗(yàn)中觀察到了相似的磷酸化事件，從而推測高突變率NSCLC細(xì)胞通過Tyr-1148、Tyr-1068磷酸化激活酪氨酸激酶活性，持續(xù)地觸發(fā)PI3K/AKT/mTOR等增殖信號(hào)。另一方面，高突變率NSCLC細(xì)胞還可同時(shí)通過減少Tyr-1045、IRS-1 Ser-612磷酸化及改變HER2異源二聚化途徑減少EGFR泛素化，使其失去對(duì)轉(zhuǎn)化抑制的能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。

3 肺癌早期診斷

肺癌的早期診斷一直是人類夢(mèng)寐以求的目標(biāo)。年齡、吸煙史、職業(yè)暴露史、咳血、體重減輕、腫塊大小、肺活量測定等變量在預(yù)測早期肺癌上尚難以作出準(zhǔn)確的判斷。Spira等[16]通過基因芯片在吸煙人群中對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，可以早期診斷潛在的罹患肺癌患者。研究者甄別出一個(gè)含80個(gè)基因簇的生物標(biāo)志物集合，通過評(píng)分系統(tǒng)在吸煙者中判斷潛在肺癌和未患肺癌的準(zhǔn)確性達(dá)到了83%，其特異性和敏感性分別為84%和80%。進(jìn)一步的研究證實(shí)該生物標(biāo)志物集合可以在早期預(yù)測I期肺癌的敏感性上達(dá)到90%，如能結(jié)合纖維支氣管鏡檢查進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析，則可將肺癌早期診斷的敏感性進(jìn)一步提高到95%。與臨床危險(xiǎn)因素所組成的模型相比，該臨床基因組學(xué)模型對(duì)預(yù)測早期肺癌的敏感性有顯著性差異。特別在臨床醫(yī)師無法確定腫塊性質(zhì)的患者當(dāng)中，運(yùn)用該基因組學(xué)模型對(duì)判斷是否罹患肺癌具有相當(dāng)高的準(zhǔn)確性[17]。Ye等[18]通過液相基因芯片技術(shù)從125例（37例小細(xì)胞肺癌，88例NSCLC）患者的組織中提取DNA進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53+EGFR二聯(lián)突變檢測對(duì)肺癌診斷的敏感性為50.4%；p53+p16+EGFR三聯(lián)突變檢測則可將敏感性提高到60%；當(dāng)聯(lián)合檢測p53、p16、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Rb、EGFR基因的突變事件時(shí)，肺癌的診斷敏感性進(jìn)一步提高到68%，且四聯(lián)基因突變檢測的特異性和準(zhǔn)確性分別為90%和72.3%。Madoz-Gúrpide等[19]使用蛋白芯片技術(shù)從肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的1,760個(gè)蛋白片段中篩選出肺癌的潛在蛋白標(biāo)記物，然后通過質(zhì)譜分析及利用肺癌患者血清與其產(chǎn)生的抗原抗體反應(yīng)確定該類蛋白為PGP9.5，而正常健康人對(duì)照則無此反應(yīng)，為肺癌的早期診斷提供了新的候選標(biāo)志物。

4 肺癌靶向治療

由于藥物基因組學(xué)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)化療藥物的分子標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，以其為指導(dǎo)的臨床試驗(yàn)不斷取得令人驚喜的結(jié)果，推動(dòng)著傳統(tǒng)化療進(jìn)入個(gè)體化靶向治療的時(shí)代。目前，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）在肺癌靶向治療中的應(yīng)用最為廣泛。在一項(xiàng)關(guān)于厄洛替尼治療NSCLC的多中心開放性臨床II期試驗(yàn)[20]中，研究者從264例處于IIIb期/IV期的NSCLC患者腫瘤組織中提取核酸進(jìn)行基因芯片分析，試圖尋找出接受厄洛替尼治療并從中獲益患者的基因表達(dá)譜特點(diǎn)。結(jié)果提示：臨床獲益患者的基因譜與無明顯效果的患者相比，EGFR、磷酸絲氨酸磷酸酶和Rap鳥苷酸交換因子5三種基因的表達(dá)顯著增高，且其表達(dá)與較長的無進(jìn)展生存期呈正相關(guān)。Seike等[21]使用含389個(gè)探針的miRNA微陣列芯片對(duì)28例非吸煙肺腺癌患者病變組織和正常對(duì)照組織比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5種miRNA表達(dá)上調(diào)，其中miR-21變化最為顯著；13種miRNA表達(dá)下調(diào)，其中miR-486和miR-126*下降最為明顯。在進(jìn)一步的研究中，作者分別探討了EGFR突變型和野生型肺腺癌細(xì)胞系H3255和 H441與miR-21表達(dá)的關(guān)系。證實(shí)EGFR無論突變與否，如能抑制miR-21表達(dá)，H3255和 H441均可發(fā)生凋亡，為肺腺癌的靶向治療提供了理論依據(jù)[20]。Stathmin蛋白家族由于其特有的微管解聚活性，在細(xì)胞的增殖和分化及腫瘤發(fā)生中有十分重要的作用。抑制Stathmin蛋白的表達(dá)已經(jīng)成為腫瘤基因治療的新的靶點(diǎn)。Singer等[22]通過組織芯片TMA技術(shù)分析了117例NSCLC肺癌患者組織中Stathmin蛋白家族Stathmin及Sclip蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果提示在鱗癌中Stathmin高度表達(dá)，而腺癌中兩者的表達(dá)水平均較正常肺組織顯著增高，尤其在組織受侵處異常明顯。作者隨后利用RNA干擾沉默其家族上游調(diào)控蛋白FBP-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不僅Stathmin及Sclip蛋白表達(dá)下調(diào)，且伴隨腫瘤細(xì)胞的遷移、侵蝕能力下降。此項(xiàng)研究為靶向治療肺癌提供了新的途徑。

5 肺癌預(yù)后

Landi等[23]使用miRNA微陣列芯片對(duì)165例腺癌和125例肺鱗癌患者進(jìn)行miRNA表達(dá)分析，試圖發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。通過分層分析，發(fā)現(xiàn)肺腺癌中暫無明顯差異表達(dá)的miRNA，但miR-25、 miR-34c-5p、miR-191、let-7e、miR-34a五種miRNA的表達(dá)對(duì)肺鱗癌的生存期具有較高的預(yù)測價(jià)值。在107例男性早期鱗癌患者中，基于交叉驗(yàn)證監(jiān)督原則所具有高死亡率風(fēng)險(xiǎn)的62例患者中最終有36例死亡（58.0%），而具有低死亡率風(fēng)險(xiǎn)的45例患者中最終僅有12例死亡（26.7%）。Chen等[24]使用DNA芯片技術(shù)分析了185例NSCLC患者的病理標(biāo)本，從672個(gè)具有侵襲特點(diǎn)基因中篩查16個(gè)與生存有關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3和LCK為5個(gè)高?；?，是患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因子。Yoshizawa等[25]利用組織芯片技術(shù)分析了300例NSCLC患者AKT信號(hào)途徑中相關(guān)蛋白磷酸化事件與其預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果提示eIF4E、AKT、TSC2、mTOR、S6和Erk1/2蛋白分別有39.9%、78.8%、5.1%、46.7%、27.1%和16.6%發(fā)生磷酸化，且eIF4E、AKT磷酸化事件無論是獨(dú)立還是聯(lián)合評(píng)估均預(yù)示較短的生存期。在聚類分析中AKT、mTOR、eIF4E、S6磷酸化陽性患者的生存期最短，而無AKT、Erk1/2磷酸化的NSCLC患者有較好的預(yù)后，其5年生存率達(dá)到了75%，平均生存中位數(shù)為9.4年。在多變量分析中，eIF4E磷酸化為判斷NSCLC患者生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。

6 展望

目前，生物芯片在國內(nèi)外已形成研究與開發(fā)的熱潮。因其技術(shù)尚無標(biāo)準(zhǔn)化平臺(tái)，各家公司的芯片技術(shù)都各具特色，數(shù)據(jù)采集出口無法統(tǒng)一，由此帶來結(jié)果評(píng)估上的混亂。但另一方面，基于生物個(gè)體遺傳信息多樣性的特點(diǎn)，生物芯片個(gè)體化發(fā)展亦成為其研發(fā)趨勢。作為一項(xiàng)可能成為實(shí)驗(yàn)室研究或臨床普遍采用的潛在技術(shù)，生物芯片在樣品制備和標(biāo)記、增加信號(hào)檢測靈敏度、功能模塊高度集成化等方面仍有較大空間改進(jìn)。相信這項(xiàng)新一代生物技術(shù)能為肺癌診斷、新藥開發(fā)、個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估等方面帶來革命性的變化。