賈杏林,黎攝兒,謝軍芳,牛俊超 ,李曉云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

乙型腦炎 (JE)是一種人畜共患傳染病,引起人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和豬的繁殖障礙性疾病[1]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,近年來寵物作為伴侶動物日益成為人們生活的一部分。小動物臨床診療中發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)癥狀患犬經(jīng)犬瘟熱檢查結(jié)果為陰性,以及一些公犬睪丸腫大,具有乙腦的癥狀,因而寵物是否攜帶乙腦病毒、是否發(fā)生乙腦疾病成為一個需要研究的課題,但目前該方面研究報道較少。為此,本研究采用傳統(tǒng)的血凝抑制試驗檢測了34份犬的血清抗體,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑為某寵物醫(yī)院就診的寵物犬血清34份;乙腦血凝抑制試驗診斷試劑購自云南流行病學(xué)防治研究所;乙腦陽性血清采用乙腦弱毒疫苗免疫犬3次制備 (HI效價為1∶40);乙腦陰性血清采自臨床健康犬 (HI結(jié)果為陰性);生理鹽水、p H7.4PBS,pH 9.0硼酸鹽緩沖液、p H6.4磷酸鹽緩沖液、12.5%高嶺土懸液采用常規(guī)配制;40%的鴿紅細胞懸液和0.5%鴿紅細胞懸液用p H 6.4磷酸鹽緩沖液配制。

1.2 試驗方法

(1)血凝試驗 首先用pH 9.0硼酸鹽緩沖液2 mL充分溶解乙腦血凝素抗原,混勻,4℃過夜,3 000 r/min離心20 min,取上清液作為血凝素抗原;加入pH 9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入25μL乙腦血凝素于第一孔中,倍比稀釋,使血凝素充分混勻,最后1孔混勻后棄掉25μL。最后每孔中加入25μL 0.5%的鵝紅細胞溶液,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。

結(jié)果判定:++++為一層粉紅色的紅細胞均勻分散于孔底;+++基本同上,但邊緣不整齊有下垂趨勢;++為紅細胞于孔底形成環(huán)狀,環(huán)中央內(nèi)徑3 mm以上;+為紅細胞于孔底形成一個圈,但邊緣不光滑,四周有小凝集塊;-為紅細胞于孔底形成圓點。以50%紅細胞出現(xiàn)凝集 (++)時,血凝素的最高稀釋度為4個單位的血凝素單位。

(2)血清處理 首先取0.1 mL血清加12.5%高嶺土溶液0.9 mL,混合后放室溫中20 min,然后2 500 r/min離心15 min,加入40%鴿紅血細胞懸液 (用p H6.4磷酸鹽緩沖液配制)0.1 mL,振蕩混勻,在37℃吸附1 h,然后1 500 r/min離心10 min,直至其不凝集0.5%鴿紅細胞,上清液即為HI試驗血清 (1∶10)。

(3)血凝抑制試驗 乙腦血凝抑制試驗按文獻 [2]的方法進行:用12.5%高嶺土溶液及40%鴿紅細胞溶液吸附待檢血清,直至完全不凝集0.5%鴿紅細胞,HI試驗采用4個單位的血凝素。加入pH 9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中,每孔25μL。再加入1∶10血清25μL于清潔干燥96孔V型微量板中于第一孔,倍比稀釋,充分混勻,最后一孔棄掉25μL。再于每孔中加入25μL血凝素,充分混勻,加蓋置室溫1 h。最后于每孔中加入0.5%的鴿紅細胞懸液50μL,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。結(jié)果判定:HI效價大于1∶20判為陽性。實驗孔全部呈現(xiàn)+++和++++的紅細胞凝集為陰性結(jié)果,陽性結(jié)果以++凝集孔作為該份血清的終點抑制效價。

2 結(jié)果與分析

從表1可知,34份被檢血清中,陽性血清21份,占總數(shù)61.8%;20份血清血凝抑制效價在1∶20～1∶80之間,占陽性血清的95.2%。

表1 34份犬血清中乙腦抗體檢測結(jié)果

3 討論

犬是人類伴侶動物,隨著我國城市化進程加快和社會經(jīng)濟的發(fā)展,其數(shù)量不斷增加,與人類關(guān)系愈來愈密切,其是否感染乙腦是一個值得研究的課題,目前尚未見到研究報道。本研究在犬血清中檢出了流行性乙型腦炎抗體,且陽性率較高,提示存在犬感染乙腦病毒的可能性,因此,有必要作進一步研究和探索。

乙腦是以腦實質(zhì)炎癥、神經(jīng)原變性、壞死為主要病理特征的中樞神系統(tǒng)疾病,從大腦到脊髓都可被侵犯[3]。在檢測的臨床樣本中,8只病犬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,但犬瘟檢測為陰性,乙腦檢測為陽性,經(jīng)問診犬只未進行過乙腦疫苗注射,因而可能為乙腦病毒侵害了犬的神經(jīng)系統(tǒng)而引起了神經(jīng)癥狀。

乙腦血凝抑制試驗可以很好地用來檢測乙腦炎病毒野毒感染產(chǎn)生的血凝素抗體效價,具有簡便、快速、靈敏、準確等特點,因而本試驗采用了該方法。但犬血清非特異性凝集較多,在試驗中發(fā)現(xiàn)用30%鴿紅細胞懸液處理犬血清后仍有一部分犬血清中非特異性凝集未消除,便將濃度提高到40%[3],消除了大部分被檢犬血清與0.5%的鴿紅細胞懸液的凝集情況,還有一些犬血清非特異性凝集仍未消除,采用鴿紅細胞泥進行吸附,這樣既沒有改變待檢血清的體積,又消除了血清中非特異性凝集。

[1]殷 震,劉景華.動物病毒學(xué) (第2版)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.633～641.

[2]自登云,陳伯權(quán),俞永新.蟲媒病毒與蟲媒病毒病 [M].昆明:云南科技出版社,1994.151～155.

[3]Jia Xinglin,Chen Huanchun,Wang Xiang,etal.Quantitativeand qualitative study of Enzyme-linked Immunosorbent Assay to detect IgG against Japanese Encep halitis Virus in swine sera[J].Veterinary Research Communications,2005,29:159～169.