李 勁，高雯琪，鄧志芳，胡文娟，歐陽(yáng)剛，劉 瑩，王朝元，姚品芳

(1中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074;2湖北省腫瘤醫(yī)院，武漢430079)

乳腺癌(Breast Carcinoma，BC)是僅次于肺癌的第二大女性惡性腫瘤殺手［1］.我國(guó)乳腺癌發(fā)病率近年來呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［2］，已成為威脅女性健康、生活和生命的重要因素.

乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果.環(huán)境因素如絕經(jīng)后雌激素的使用、酒精的消耗和較少的體育活動(dòng)等起著一定的作用［3］.然而癌癥的發(fā)生有個(gè)體差異，當(dāng)整體人群暴露于相同的環(huán)境因素中時(shí)，只有少數(shù)人群患病，這就提示個(gè)體之間存在腫瘤易感性的差異.在基因水平上，最顯著影響不同個(gè)體對(duì)外界刺激產(chǎn)生差異反應(yīng)的即為單核苷酸多態(tài)性.Ou Y G 等［4，5］利用病例-對(duì)照分析，研究發(fā)現(xiàn)MMP-3基因外顯子2中Lys45Glu的SNP多態(tài)性(rs679620)與食管鱗狀上皮細(xì)胞癌相關(guān)，但rs679620與乳腺癌相關(guān)性尚未見報(bào)道.本研究利用PCR-RFLP方法對(duì)湖北省武漢市散發(fā)患者和湖北省武漢市正常人群進(jìn)行MMP3基因分型分析，旨在發(fā)現(xiàn)MMP3基因Lys45Glu的單核苷酸多態(tài)性rs679620與乳腺癌遺傳易感性的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象

湖北省武漢市女性乳腺癌散發(fā)患者EDTA抗凝血標(biāo)本由湖北省腫瘤醫(yī)院收集;湖北省武漢市正常對(duì)照女性EDTA抗凝血標(biāo)本由湖北省武漢市中醫(yī)院和湖北省陸軍總醫(yī)院收集.所有標(biāo)本于－70°C保存.本實(shí)驗(yàn)中研究對(duì)象按病理診斷分為2組(病例組和對(duì)照組)，各實(shí)驗(yàn)組的個(gè)體年齡均大于40歲.病例組和對(duì)照組在年齡、性別的分布上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＞0.05).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

德國(guó)BioMetra PCR儀;冷凍離心機(jī)(Sigma);超級(jí)恒溫水浴槽SYC-15C(金壇市科興儀器廠);－80℃冰箱(SANYO);組織勻漿器;ASWO-0005-U超純水系統(tǒng)(Aquapro);Power Pac HC型電泳儀(Bio-RAD);Mini PROTEAN3 cell型電泳槽(Bio-RAD);TY-80B脫色搖床(金壇市科興儀器廠);EPSON PERFECT10N 4990 PHOTO掃描儀.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Chelex-100為Sigma分裝，引物、dNTP購(gòu)于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，Taq聚合酶購(gòu)于天根生化科技(北京)公司，Taq I內(nèi)切酶購(gòu)于 Promega公司.

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和限制酶篩選

根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，查取 MMP3基因序列信息，利用軟件Primer Premier(version5.0)設(shè)計(jì)引物和篩選限制性內(nèi)切酶，分別見表1和表2.

表1 引物的設(shè)計(jì)Tab.1 Primer sequences in the experiments

表2 限制酶的選擇Tab.2 Selected restrict enzyme

1.2.2 外周血基因組DNA的Chelex-100提取

取20μL人體外周血于1.5 mL離心管中，加1 mL滅菌蒸餾水，混勻，冰上放置15 min.13000 r/min離心3 min，去上清，收集白細(xì)胞沉淀.移取200 μL 5%Chelex-100溶液加至含白細(xì)胞沉淀的離心管中，充分振蕩，56℃水浴30 min，取出振蕩，冰上放置3 min，13000 r/min離心3 min，上清作為模板用于 PCR 擴(kuò)增［6］.

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

按照特定說明書配置PCR體系，本實(shí)驗(yàn)PCR體系見表3.

經(jīng)梯度PCR實(shí)驗(yàn)后確定最優(yōu)PCR反應(yīng)程序:①94℃，5 min;②94℃，1 min;③56℃，30 s;④72℃，1 min;⑤回到步驟②35個(gè)循環(huán);⑥72℃，15 min;⑦4℃，2 h.PCR反應(yīng)結(jié)束后，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，凝膠成像儀拍照.

表3 PCR體系Tab.3 System of PCR

1.2.3 限制性內(nèi)切酶酶切

按照特定限制酶的產(chǎn)品說明書體系和要求進(jìn)行酶切.

1.2.4 聚丙酰胺凝膠電泳法對(duì)基因分型的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)所用凝膠濃度為8%，以1×TBE為電解液，電壓15 V/cm.電泳完成后，將凝膠置于固定液(10% 乙醇，0.5% 冰乙酸)中10～20 min.倒出固定液，加入染色液(0.2%AgNO3)覆蓋凝膠，置于搖床上緩慢搖晃15～20 min.倒出染色液，用超純水漂洗凝膠3～4次，加入顯色液(1.5%NaOH，0.4% 甲醛)覆蓋凝膠，輕輕晃動(dòng)10～20 min后加入終止液(0.75%Na2CO3)終止顯色.銀染結(jié)束后，直接拍照或掃描保存圖片，肉眼觀察并記錄基因分型情況.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)中涉及的人群信息，包括年齡、是否患乳腺癌、SNP位點(diǎn)等位基因分型數(shù)據(jù)，首先輸入EXCEL里進(jìn)行初步處理;然后運(yùn)用SPSS 13.0軟件包，進(jìn)行Χ2檢驗(yàn)、logistic regression分析等;用 SHEsis軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php) 計(jì) 算HWE值.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取結(jié)果

用Chelex-100提取人外周血基因組因基因組DNA產(chǎn)量太少，不能用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，因此直接進(jìn)行PCR反應(yīng).

2.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

將人外周血基因組DNA PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的結(jié)果見圖1.

由圖1可知，PCR產(chǎn)物均為748 bp，DNA帶型整齊亮度適宜，除100 bp以下引物二聚體DNA帶外，無明顯的非特異性雜帶，表示PCR結(jié)果較好.

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR production

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳基因分型結(jié)果

PCR產(chǎn)物酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳基因分型結(jié)果見圖2.

由圖2可知，rs679620經(jīng)Taq I完全酶切后產(chǎn)生3種結(jié)果，A泳道為純合型完全酶切，上下2個(gè)片段大小分別為432、316 bp，即G/G基因型;B泳道為雜合型半數(shù)酶切，從上到下3個(gè)片段大小分別為748、432、316 bp，即A/G基因型;C泳道為純合型完全不酶切，此單一片段大小為748 bp，即A/A基因型.

圖2 rs679620基因分型Fig.2 Genotype of rs679620

2.4 HWE 值計(jì)算

采用 SHEsis軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)計(jì)算病例組和對(duì)照組的HWE值.

病例組及對(duì)照組人群的Hardy-Weinberg數(shù)值分別為0.388 和0.214，均大于0.05，表明本實(shí)驗(yàn)選擇的研究人群(包括病例組和對(duì)照組)符合孟德爾遺傳，且群體中個(gè)體等位基因頻率和基因型頻率的分布比例維持恒定，是符合遺傳平衡的群體和良好的研究對(duì)象.

2.5 rs679620等位基因頻率、基因型頻率計(jì)算

運(yùn)用SPSS軟件(version15.0)計(jì)算rs679620各等位基因頻率以及3種基因型的頻率，結(jié)果見表4和表5.

對(duì)rs679620進(jìn)行病例-對(duì)照分析，病例組A等位基因頻率(P=0.331)小于對(duì)照組(P=0.360)，但兩者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05).病例組和對(duì)照組在AA、AG和GG基因型頻率分布上差異不明顯(P＞0.05).表明rs679620單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與乳腺癌易感性不相關(guān).但由表6中數(shù)據(jù)趨勢(shì)分析，病例組A等位基因頻率(0.331)略小于對(duì)照組(0.360)，可以推斷，rs679620 A等位基因在腫瘤的發(fā)生和侵染過程中可能是保護(hù)因素.

表4 MMP-3基因單位點(diǎn)SNPs的基因型頻率差異Fig.4 Difference of genotype frequency on independent SNP site of MMP-3 between case and control

表5 MMP-3基因單位點(diǎn)SNPs的等位基因頻率差異Fig.5 Difference of allele frequency on independent SNP sites of MMP-3 between case and control

3 討論

由 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢可知，單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs679620(A/G，Lys45Glu，exon_2)為MMP-3蛋白2號(hào)外顯子第45位氨基酸的錯(cuò)意突變.Eguchi T等［7］發(fā)現(xiàn)MMP-3有轉(zhuǎn)錄因子和核定位功能，其所具有的核定位信號(hào)NLS0序列涵蓋MMP3的44-56位氨基酸(LKKDVKQFVRRKD)，而rs679620(A/G)位點(diǎn)多態(tài)性，正好是第45位氨基酸Lys(K)和Glu(E)之間的變換.rs679620(A/G)的A等位基因?qū)?yīng)的氨基酸Lys為酸性帶負(fù)電荷，G等位基因?qū)?yīng)的氨基酸Glu為堿性帶正電荷.這種存在于編碼區(qū)中的帶電荷氨基酸和電荷性質(zhì)的明顯改變有可能會(huì)導(dǎo)致MMP3蛋白結(jié)構(gòu)的改變和功能的異常［8］，因此rs679620有可能影響MMP-3向細(xì)胞核內(nèi)的定位.MMP-3 rs679620位點(diǎn)A等位基因可促進(jìn)MMP-3向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并更有利于誘導(dǎo)凋亡.由此可推斷，rs679620 A等位基因在腫瘤的發(fā)生和侵染過程中是保護(hù)因素.因此，整體分析表明，在中國(guó)武漢地區(qū)漢族女性中，MMP-3 rs679620(A/G)位點(diǎn)的A等位基因可能為保護(hù)因素，病例和對(duì)照的差異雖然不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.但呈現(xiàn)一定的趨勢(shì)，需加大樣本量和增加考察的SNP數(shù)量進(jìn)行深入研究.

SNPs被認(rèn)為是最具應(yīng)用潛力的新一代遺傳標(biāo)志物.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性與癌癥的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從而為癌癥的預(yù)防和臨床診斷治療等提供分子標(biāo)志物，具有疾病預(yù)防和診斷等方面的重要意義.

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