閆斌 韓麗紅 于躍利
乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)占全身各種惡性腫瘤的7%~10%。近年來(lái),線粒體DNA(m itochond rial DNA,m tDNA)突變與腫瘤關(guān)系的研究越來(lái)越受到人們的重視,并且在多種人類腫瘤中都已檢測(cè)到m tDNA突變。本研究擬通過(guò)對(duì)乳腺癌組織m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)測(cè)序分析,了解中國(guó)人乳腺癌m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ的突變情況,以期為乳腺癌病因?qū)W的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為臨床乳腺癌的診斷和治療提供參考。
1.1 材料
隨機(jī)收集2008年1月~2009年1月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科切除的乳腺癌組織標(biāo)本20例,以及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,標(biāo)本取回后于-80℃冰箱保存,均經(jīng)該院病理科證實(shí)為乳腺癌。
1.2 乳腺癌組織標(biāo)本m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)PCR擴(kuò)增
按照DNA提取試劑盒((Prom gea公司)說(shuō)明書提取20例乳腺癌組織和癌旁組織的DNA。通過(guò)軟件分析設(shè)計(jì)出一對(duì)引物,上游引物:5’-atggcacatgcagcgcaag t-3’,下游引物:5’-ggtaaatacgggccctatttc-3’。PCR反應(yīng)體系50μL,水33.5μL,10×bu ffer(無(wú)M g2+)5μL,上、下游引物各1μL,4×dNTP4μL,25mM的Mgcl24μL,Taq DNA聚合酶0.5μL(試劑均來(lái)自Promega公司),DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件:94℃5m in;94℃15s,65℃30s,72℃40s,35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳,電壓120V,電泳30m in。凝膠成像分析系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。
1.3 測(cè)序及分析
由百泰克公司使用A BI3730X L測(cè)序儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序果用Bioed it軟件進(jìn)行分析,與Gen Ban k序列(AC_000021)對(duì)比,在PUBMED網(wǎng)上進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),確定是否為突變。
2.1 細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果,見(jiàn)圖1。
2.2 細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)
見(jiàn)表1。20例乳腺癌患者癌組織中共有4例m tDNA細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)存在突變,突變率為20%。癌旁組織中共有2例m tDNA細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)存在突變,突變率為10%。在20例乳腺癌組織中共有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變,其中引起編碼氨基酸改變的突變有1個(gè)。
腫瘤是多因素多步驟發(fā)展的產(chǎn)物,各種致癌物既然能有效地作用于m tDNA引起其產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的遺傳改變,那么m tDNA在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)意義必將得到重視。因此,深入研究腫瘤細(xì)胞m tDNA的結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控變化,探討m tDNA突變與腫瘤的關(guān)系,對(duì)闡明細(xì)胞的癌變機(jī)制具有重要意義。目前已知多種腫瘤與m tDNA的突變有關(guān),但對(duì)于它們的研究還只處于起步階段,還沒(méi)有得到m tDNA與細(xì)胞癌變直接相關(guān)的證據(jù)[1]。但有研究表明在小鼠癌細(xì)胞系中使用胞質(zhì)雜交技術(shù)代替內(nèi)生的m tDNA,結(jié)果顯示m tDNA突變能夠通過(guò)提高癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[2]。
表1 20例乳腺癌組織和癌旁組織中細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ突變情況
圖1 乳腺癌組織細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
m tDNA突變已在多種人類惡性腫瘤中被證實(shí),m tDNA自身的易受損性和組成性的氧化壓力使其缺陷成為惡性細(xì)胞的重要特征之一。但是,目前人們研究D-Loop區(qū)突變的比較多。本研究側(cè)重于研究細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)突變,國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。
細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ是細(xì)胞色素氧化酶的活性中心,是細(xì)胞色素C電子傳遞的入口,也是細(xì)胞色素氧化酶電子泄露產(chǎn)生活性氧的主要部位,因此保持細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ的正常結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于維持正常的線粒體功能和細(xì)胞能量代謝具有重要作用。細(xì)胞色素氧化酶基因的突變不僅導(dǎo)致突變部位附近殘基的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)環(huán)境發(fā)生極大的變化(包括電荷性質(zhì)、親疏水性質(zhì)和空間特性),直接影響了酶復(fù)合物的形成,而且該酶幾個(gè)亞單位之間相互作用區(qū)域受到了影響,整個(gè)酶分子的穩(wěn)定性大大下降[3]。大量證據(jù)表明,細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步驟。凋亡過(guò)程中細(xì)胞色素C的釋放是線粒體外膜通透性增高的結(jié)果[4]。線粒體在凋亡過(guò)程中起中心控制作用,而細(xì)胞色素C的釋放則是支配細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。有關(guān)這一信號(hào)途徑及其相關(guān)事件的認(rèn)識(shí),對(duì)進(jìn)一步了解凋亡的正常生理和病理過(guò)程,及其在腫瘤中的失調(diào)控具有重要意義。
我們的研究在乳腺癌患者中細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變率為20%,說(shuō)明了在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中線粒體細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。這些改變中,究竟哪些是多態(tài)性,哪些是與疾病相關(guān)的突變目前尚不清楚。這種突變的意義是正常多態(tài)性還是與乳腺癌密切相關(guān)尚不清楚,結(jié)合文獻(xiàn)我們認(rèn)為,突變導(dǎo)致編碼氨基酸的改變可能引起線粒體功能異常,從而對(duì)乳腺癌的發(fā)病產(chǎn)生一定影響。雖然根據(jù)我們的結(jié)果尚不能認(rèn)為m tDNA突變?cè)谌橄侔┌l(fā)病中起決定性的作用,但m tDNA突變可能是發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)前期或伴隨現(xiàn)象,即這種突變可能在乳腺癌的發(fā)病前就存在于體細(xì)胞線粒體,提高了發(fā)生乳腺癌的易感性。
在我們研究的乳腺癌組織中同樣有胞質(zhì)異質(zhì)性:線粒體幾乎存在于人體的所有細(xì)胞中,每個(gè)細(xì)胞中含有成百上千個(gè)線粒體,因此部分細(xì)胞在連續(xù)分裂過(guò)程中發(fā)生有絲分裂遺傳演變而導(dǎo)致組織中同時(shí)存在含野生型和突變型的兩種細(xì)胞,這種狀態(tài)稱為線粒體的胞質(zhì)異質(zhì)性。線粒體異質(zhì)性是乳腺癌患者的一種較為普遍的現(xiàn)象。譚氏等研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中約半數(shù)體細(xì)胞性突變處于異質(zhì)狀態(tài),其原因考慮有兩個(gè)方面:其一,由于在腫瘤標(biāo)本取材過(guò)程中受到正常細(xì)胞的少量“污染”,在隨后的反應(yīng)中使得“污染”得到數(shù)萬(wàn)倍的擴(kuò)增,因此,測(cè)序結(jié)果顯示為異質(zhì)狀態(tài)。其二,已觀察到的異質(zhì)性與腫瘤發(fā)生學(xué)上進(jìn)展特征相同,可能代表著腫瘤的真實(shí)現(xiàn)象,而非污染所致。提示分子水平的改變發(fā)生在大體形態(tài)學(xué)變化之前,腫瘤發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程。
乳腺癌中m tDNA突變是比較普遍的,m tDNA突變可能是誘導(dǎo)核DNA突變的內(nèi)源性因素之一。m tDNA突變可能會(huì)通過(guò)影響呼吸鏈的合成和核DNA與m tDNA基因相互調(diào)控,使核基因突變幾率增大以及引起細(xì)胞凋亡紊亂,對(duì)乳腺癌發(fā)生和發(fā)展可能起著比較重要的作用[5]。
總之,中國(guó)人乳腺癌中m tDNA突變是一個(gè)普遍的現(xiàn)象,它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的作用。細(xì)胞色素氧化酶在人體內(nèi)分布十分廣泛,它的突變與人類疾病發(fā)生有密切的關(guān)系,雖然檢測(cè)乳腺癌患者線粒體DNA編碼細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因的突變情況,但是突變位點(diǎn)氨基酸序列的改變、多肽疏水性的變化、蛋白質(zhì)空間構(gòu)想的改變等,還有很多問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。
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[3]蔡黔,周紅,徐淑芬,等.過(guò)氧化氫導(dǎo)致線粒體DNA編碼細(xì)胞色素C氧化酶基因突變與其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(1):60-68.
[4]李娜,高俊巖,劉敏.細(xì)胞凋亡和腫瘤的關(guān)系研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009,15(16):13-14.
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