孫文芳，王偉，嚴(yán)拯宇

(中國藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇南京 211198)

磺丁基醚－β－環(huán)糊精手性流動相添加劑法分離鹽酸昂丹司瓊對映體

孫文芳，王偉*，嚴(yán)拯宇＊＊

(中國藥科大學(xué)分析化學(xué)教研室，江蘇南京 211198)

目的:建立反相高效液相色譜手性流動相添加劑法拆分鹽酸昂丹司瓊對映體。方法:采用Hedera C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱，考察手性添加劑的種類和濃度、水相pH、緩沖鹽的種類和濃度、有機相的種類和比例、柱溫等對鹽酸昂丹司瓊對映體拆分效果的影響。結(jié)果:當(dāng)流動相為10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(含5 mmol·L－1磺丁基醚－β－環(huán)糊精，磷酸調(diào)至pH 3.0)－甲醇(75∶25)，檢測波長為310 nm，流速為1.0 mL·min－1，柱溫為25℃時，鹽酸昂丹司瓊對映體可達到基線分離。結(jié)論:該方法可實現(xiàn)鹽酸昂單司瓊對映體基線分離，且操作簡便，比手性固定相法更經(jīng)濟。

反相高效液相色譜法;鹽酸昂丹司瓊;手性流動相添加劑;磺丁基醚－β－環(huán)糊精;對映體分離

鹽酸昂丹司瓊(ondansetron hydrochloride，1)，化學(xué)名為(±)－2，3－二氫－9－甲基－3－［(2－甲基－咪唑－1－基)甲基］－4(1H)－咔唑酮鹽酸鹽二水合物，是葛蘭素公司于1990年投放市場的第一個高選擇性5－HT3受體拮抗劑，用于預(yù)防和治療癌癥患者因化療所致惡心和嘔吐等，具有高效、低毒、安全等特點。目前有關(guān)昂丹司瓊對映體分離方法的文獻報道主要集中在對手性固定相，如蛋白質(zhì)及纖維素衍生物手性固定相、萬古霉素手性固定相、直鏈淀粉手性固定相的選擇與應(yīng)用上［1－3］;此外，也有人將毛細(xì)管電泳手性添加劑法用于其對映體的分離［4－5］。然而，手性柱價格昂貴且易損壞，毛細(xì)管電泳色譜法則重現(xiàn)性較差，因此，筆者嘗試選用適當(dāng)?shù)氖中粤鲃酉嗵砑觿?，在普通C18色譜柱上拆分鹽酸昂丹司瓊對映體。考慮到鹽酸昂丹司瓊的結(jié)構(gòu)中有3個N原子，可形成帶正電的陽離子，且其結(jié)構(gòu)中含疏水性的剛性結(jié)構(gòu)，按照Dalglesish的三點作用理論，其可分別與磺丁基醚－β－環(huán)糊精(SBE－β－CD)疏水性空腔的內(nèi)部和鍵合在環(huán)糊精上的磺丁基所形成的陰離子產(chǎn)生相互作用，達到手性拆分的效果，本文以SBE－β－CD為手性流動相添加劑，在Hedera C18柱上成功分離了鹽酸昂丹司瓊對映體。該法拓寬了帶負(fù)電的環(huán)糊精衍生物作為手性流動相添加劑的應(yīng)用范圍，對研究昂丹司瓊與磺丁基醚－β－環(huán)糊精的相互作用提供了理論依據(jù)，同時對于昂丹司瓊單一對映體的開發(fā)、質(zhì)量控制及立體選擇性藥動學(xué)研究具有實際意義［6－9］。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

LC－10AT型液相色譜儀、SPD－10Avp紫外檢測器(均為日本島津公司);BS124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);PHS－3C型精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

鹽酸昂丹司瓊消旋體(武漢醫(yī)藥原料廠，化學(xué)純度＞99.0%);β－環(huán)糊精(β－CD，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，羥丙基－β－環(huán)糊精(HP－β－CD，平均取代度為6.0，泰興一鳴生物有限公司)，SBE－β－CD (平均取代度為6.2，南京師范大學(xué)超分子化合物重點研究室饋贈);甲醇(江蘇漢邦科技有限公司，色譜純)，乙腈(MERCK化學(xué)試劑，色譜純)，醋酸銨(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)，磷酸二氫鈉、磷酸(均為南京化學(xué)試劑有限公司，分析純);水為市售純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱:漢邦Hedera ODS－2柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(含5 mmol·L－1SBE－β－CD，磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)－甲醇(75∶25);流速為1.0 mL·min－1;柱溫:25℃;檢測波長為310 nm;進樣量:20μL。

1.3 供試品溶液的制備

取鹽酸昂丹司瓊10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 000 mg·L－1的鹽酸昂丹司瓊貯備液。精密移取1 mL貯備液至10 mL容量瓶中，用流動相稀釋定容，得100 mg·L－1的鹽酸昂丹司瓊?cè)芤海鳛楣┰嚻啡芤骸?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 影響分離的因素考察

2.1.1 手性添加劑種類及濃度對分離的影響在10 mmol·L－1NaH2PO4溶液(磷酸調(diào)至pH 3.0)中，分別添加β－CD、HP－β－CD和SBE－β－CD作為流動相水相，其余色譜條件同“1.2”節(jié)，分離鹽酸昂丹司瓊對映體。結(jié)果表明:β－CD、HP－β－CD作為手性添加劑時，對映體完全無法分離，僅SBE－β－CD可使鹽酸昂丹司瓊對映體達到基線分離。進一步考察SBE－β－CD的濃度對鹽酸昂丹司瓊對映體的分離度R和保留時間tR產(chǎn)生的影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SBE－β－CD濃度為1～10 mmol·L－1時，隨濃度的增加，保留時間tR減少，分離度R逐漸增加，但當(dāng)濃度達2.5 mmol·L－1以上時，增加濃度對分離度的影響不再明顯(見表1)。

表1 SBE-β-CD濃度對分離的影響Table 1 The influence of sulfobutyl ether－β－cyclodextrin concentration on the separation

這其中的原因可能是SBE－β－CD濃度低時，隨著濃度的增加，鹽酸昂丹司瓊與手性添加劑相互作用的概率增大，導(dǎo)致分離度增加，保留時間減少;而當(dāng)SBE－β－CD濃度較高時，鹽酸昂丹司瓊與手性添加劑相互作用達到閾值，濃度不再成為影響分離度的主要因素，此時，藥物－環(huán)糊精復(fù)合物與未結(jié)合環(huán)糊精的競爭作用導(dǎo)致保留時間繼續(xù)減少?？紤]到SBE－β－CD濃度過大不僅增加柱壓，對色譜柱也有較大損傷，故最終選擇5 mmol·L－1SBE－β－CD作為手性添加劑的濃度。

2.1.2 水相pH對分離的影響用磷酸將含5 mmol·L－1SBE－β－CD的10 mmol·L－1NaH2PO4溶液調(diào)至不同的pH值，其余色譜條件同“1.2”節(jié)，分離鹽酸昂丹司瓊對映體。結(jié)果表明:在pH 3.0～6.0范圍內(nèi)，隨pH增加，對映體的保留時間呈增加趨勢，而分離度變化并不明顯(見表2)?？紤]到pH較高時，對映體保留時間過長，故最終選擇水相pH為3.0。

表2水相pH對分離的影響Table 2 The influence ofwater phase pH on the separation

2.1.3 緩沖鹽的種類和濃度對分離的影響分別用10 mmol·L－1的NaH2PO4溶液和20 mmol·L－1的 CH3COONH4溶液(均含5 mmol·L－1SBE－β－CD，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)作為流動相水相，其余色譜條件同“1.2”節(jié)，對鹽酸昂丹司瓊對映體進行分離。結(jié)果表明:在其他條件相同的情況下，緩沖鹽的種類對對映體的分離無明顯影響(見表3)，考慮到NaH2PO4溶液相對CH3COONH4溶液有更寬的pH緩沖范圍，因此選擇NaH2PO4溶液作為緩沖鹽。進一步比較了不同濃度的NaH2PO4溶液(10、20 mmol ·L－1)對分離的影響，發(fā)現(xiàn)其濃度雖對分離不產(chǎn)生影響，但濃度較高時會延長保留時間，故選擇NaH2PO4緩沖鹽濃度為10 mmol·L－1。

表3緩沖鹽的種類和濃度對分離的影響Table 3 The influence of the type and concentration of buffer on the separation

2.1.4 有機相的種類和比例對分離的影響在不改變水相組成的基礎(chǔ)上，分別以甲醇、乙腈為有機相，其余色譜條件同“1.2”節(jié)，考察不同有機相及流動相的比例對鹽酸昂丹司瓊對映體分離的影響。結(jié)果表明:乙腈的洗脫能力更強，但甲醇的分離能力更佳，在洗脫較快的對映體保留時間同為18 min時，以乙腈為有機相時得到的對映體分離度為1.80，而以甲醇為有機相時的分離度達2.27。此外，甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時，兩對映體可達到基線分離，保留時間分別為18和20 min;而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)從25%減小到20%時，分離度雖稍有增加，但保留時間顯著延長;當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)由25%增至30%時，兩對映體分離度顯著降低，無法達到基線分離。綜上，最終選擇25%甲醇為流動相的有機相。

2.1.5 柱溫對分離的影響在其他分離條件同“1.2”節(jié)的情況下，考察柱溫為25、30、35、40℃時，鹽酸昂丹司瓊對映體的分離情況。結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，保留時間減少，分離度也略有降低(見表4)。從分離度的變化趨勢判斷，低溫較有利于分離，同時考慮到方法的適用性，故最終選擇柱溫為25℃。

表4柱溫對分離的影響Table 4 Influences of column temperature on the separation

2.2 方法有效性考察

本實驗對優(yōu)化色譜條件下鹽酸昂丹司瓊的線性范圍、進樣精密度和最低檢測限作了進一步考察。配制質(zhì)量濃度分別為10、20、60、100、120、140、180 mg·L－1的鹽酸昂丹司瓊系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖(見圖1)。并以峰面積(A)對溶液質(zhì)量濃度(C，mg·L－1)進行回歸，得對映體A和B的面積－濃度回歸方程分別為:

另將100 mg·L－1的鹽酸昂丹司瓊?cè)芤哼B續(xù)進樣6次，結(jié)果得兩對映體保留時間的RSD分別為0.39%和0.37%，峰面積的RSD分別為0.73%和1.2%，表明該實驗條件下鹽酸昂丹司瓊各個單體的保留時間和響應(yīng)峰面積的重復(fù)性良好。將100 mg·L－1的鹽酸昂丹司瓊?cè)芤憾啻蜗♂尯蟮玫叫旁氡?S/N)為3的溶液，將此濃度作為最低檢測限，結(jié)果顯示，鹽酸昂丹司瓊兩對映體單體的最低檢測限均為18μg·L－1。

圖1鹽酸昂丹司瓊對映體的色譜圖Figure 1 Chromatogram of ondansetron hydrochloride enantiomers

3 結(jié)論

以SBE－β－CD為手性流動相添加劑的RP－HPLC法，載樣量遠高于毛細(xì)管電泳法，方法穩(wěn)定性較好，此外，該法還能獲得較低的檢測限和較高的線性和精密度，在保證鹽酸昂丹司瓊兩個單體間達到完全分離的前提下，可作為鹽酸昂丹司瓊單一對映體含量測定的方法。

［1］尹燕杰，張啟明，田頌九.蛋白質(zhì)及纖維素衍生物手性固定相分離鹽酸昂丹司瓊對映體［J］.藥物分析雜志，2009，29(6):971－974.

［2］段明郁，陳笑艷，鐘大放.手性固定相色譜法直接拆分曲美布汀、拉映替丁和昂丹司瓊對映異構(gòu)體［J］.藥物分析雜志，2006，26(9):1187－1191.

［3］潘永玉，于莉，郭云珍，等.直鏈淀粉手性固定相分離馬來酸曲美布汀和昂丹司瓊對映體［J］.分析化學(xué)，2007，35(6):880－882.

［4］Siluveru M，Stewart JT.Enantioselective determination ofS－(+)－andR－(－)－ondansetron in human serum using derivatized cyclodextrin－modified capillary electrophoresis and solid－phase extraction［J］.JChromatogr B，1997，691 (1):217－222.

［5］Ren XQ，Dong Y Y，Liu J Y.Separation of chiral basis drugs with sulfobutyl－β－cyclodextrin in capillary electrophoresis［J］.Chromatographia，1999，50(5/6):363－368.

［6］Khan M，Viswanathan B，Rao D S，etal.A validated chiral CE method for frovatriptan，using cyclodextrin as chiral selector［J］.J Pharm Biomed Anal，2006，41(4): 1447－1452.

［7］徐穎，鄧小燕，李樹剛，等.β－環(huán)糊精手性流動相添加劑法拆分佐匹克隆對映體［J］.藥學(xué)進展，2006，30 (9):418－421.

［8］周采菊，劉瑛.HPLC手性流動相添加劑法拆分馬來酸氨氯地平［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(9): 757－759.

［9］關(guān)瑾，楊晶，石爽，等.磺丁基醚－β－環(huán)糊精手性流動相添加劑法分離蘭索拉唑?qū)τ丑w［J］.分析試驗室，2009，28(2):91－93.

Enantiomeric Separation of Ondansetron Hydrochloride by RP-HPLC Using Sulfobutyl Ether-β-cyclodextrin as a Chiral Additive

SUNWen－fang，WANGWei，YAN Zheng－yu

(DepartmentofAnalyticalChemistry，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing211198，China)

Objective:To establish a HPLCmethod with a chiralmobile phase additive for the enantiomeric separation of ondansetron hydrochloride.MethodsThe Hedera C18column(250 mm×4.6 mm，5μm)was used.The influences of type and concentration of sulfobutyl ether－β－cyclodextrin，buffer pH，the type and concentration of buffer，the type and ratio of organic phase and column temperature on the resolution of enantiomers were investigated.Results:The baseline separation of ondansetron hydrochloride enantiomers was achieved at25℃on the reversed－phase C18column with amobile phase of10 mmol?L－1NaH2PO4(containing 5mmol?L－1sulfobutyl ether－β－cyclodextrin，pH 3.0)－methanol(75∶25)at the flow rate of 1.0 mL?min－1.Conclusion:Ondansetron hydrochloride enantiomers can be baseline－separated bythismethod which is simple and economic with good resolution.

RP－HPLC method;ondansetron hydrochloride;chiral mobile phase additive;sulfobutyl ether－β－cyclodextrin;enantiomeric resolution

R 914

B

1001－5094(2011)05－0220－04

10.3969/j.issn.1001－5094.2011.05.004

［接受日期］2011－01－28

*通訊作者:王偉，講師;

研究方向:儀器分析;

Tel:025－86185150;E-mail:qkhcpu@126.com

＊＊通訊作者:嚴(yán)拯宇，教授;

研究方向:儀器分析;

Tel:025－86185150;E-mail:yanzhengyujiang@hotmail.com

(責(zé)任編輯:邢愛敏)