彭淑梅 嚴 紅 羅 欣 (井岡山大學醫(yī)學院臨床系實驗室,江西 吉安 343000)
Livin和Smac在大腸癌組織中的表達及相關(guān)性分析
彭淑梅 嚴 紅 羅 欣1(井岡山大學醫(yī)學院臨床系實驗室,江西 吉安 343000)
目的 檢測Livin和Smac在人大腸癌組織中的表達并分析其臨床意義。方法 收集42例大腸癌組織和22例正常大腸組織,用免疫組織化學方法和RT-PCR檢測Livin和Smac的蛋白及mRNA表達情況。結(jié)果 大腸癌組織中Livin的表達率高于正常大腸組織(P<0.001),Smac的表達率則低于正常大腸組織(P<0.001),Livin與Smac的表達呈負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 Livin和Smac可能是大腸癌細胞凋亡信號傳導通路中的重要環(huán)節(jié)。
Livin;Smac;大腸癌;凋亡
近年來,誘導腫瘤細胞凋亡成為大腸癌防治的熱點之一。Livin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的成員之一,對抑制細胞凋亡起著重要作用〔1〕。Smac是新近發(fā)現(xiàn)的直接抑制IAPs的蛋白,能夠與Livin結(jié)合成Smac-Livin復合物,解除Livin的抑制作用,發(fā)揮促凋亡作用〔2〕。本研究檢測大腸癌組織和正常大腸組織中Livin和Smac的蛋白及mRNA表達,旨在探討兩者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
1.1 臨床資料 收集2009年3月至2010年10月井岡山大學附屬醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌標本42例,其中男22例,女20例,年齡30~79歲,中位年齡56.5歲。按Dukes分期分類:A期7例,B期15例,C期15例,D期5例?;颊咝g(shù)前均未采用放療、化療或針對腫瘤的其他治療,術(shù)后均經(jīng)病理學診斷證實。22例正常對照標本取自經(jīng)病理證實無腫瘤殘留的結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本的切緣。
1.2 方法
1.2.1 Livin蛋白和Smac蛋白的檢測 手術(shù)標本用10%甲醛固定24 h,常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,閱片證實為結(jié)直腸腺癌或正常組織。另取切片行免疫組織化學染色,采用PV-9000二步法,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。免抗人Livin多克隆抗體為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品,濃度為1∶50。兔抗人Smac多克隆抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品,濃度為1∶200。PV-9000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.2.2 蛋白檢測結(jié)果判斷 Livin和Smac陽性染色為棕黃色顆粒,主要在胞質(zhì)中表達。每張切片在10×40倍光鏡下隨機觀察5個視野,計算陽性細胞數(shù)。分級方法如下:染色強度,不著色為0,輕度著色為1,中度著色為2,強著色為3;陽性細胞所占百分比:無著色比為0,<10%為1,10% ~50%為2,>50%為3。兩種積分相加,依照0為(-)、1~2為(+)、3~4為()、5~6為(),進行半定量判斷:(-)為陰性、(+)為弱陽性、()為陽性、()為強陽性,進行統(tǒng)計學分析時(+~)皆為陽性。
1.2.3 Livin mRNA和Smac mRNA的檢測 手術(shù)標本離體后立即放入高壓滅菌后的凍存管中,液氮凍存,盡快提取RNA。RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳,通過Band Scan圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的灰度值,以β-actin條帶的灰度值標化其相應(yīng)的 Livin α、Livin β和 Smac表達量。用 Primer5.0軟件設(shè)計引物,由上海生工生物技術(shù)公司合成。Livin的上游引物為 5′CGCACGGCACAAAGACGA 3′,下游引物為 5′GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA 3′,Livin α 與 Livin β 的產(chǎn)物長度分別為351 bp和297 bp。內(nèi)參照 β-actin的上游引物為 5′AGCCATGTACGTAGCCATCC 3′,下游引物為 5′CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 3′,擴增片段為228 bp。Livin和β-actin反應(yīng)條件:95℃預變性5 min,然后 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min 擴增 32 個循環(huán),最后72℃延伸10 min。Smac的上游引物為5′GTGCGGTTCCTATTGC 3′,下游引物為 5′GATTCCTGGCGGTTAT 3′,擴增片段為393 bp。反應(yīng)條件:95℃預變性5 min,然后94℃ 30 s、43℃ 30 s、72℃ 1 min擴增32個循環(huán),最后72℃延伸10 min。
1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件,率的比較采用χ2檢驗,相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。計量資料采用t檢驗。
2.1 兩組中Livin蛋白和Smac蛋白表達情況的比較 大腸癌組織中Livin蛋白陽性表達率為66.7%(28/42),而正常大腸組織僅為13.6%(3/22),大腸癌組織明顯高于正常大腸組織(χ2=16.256,P<0.001)。Smac蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率為42.9%(18/42),正常大腸組織陽性表達率為72.7%(16/22),高于大腸癌組織(χ2=5.173,P <0.05)。
2.2 兩組中Livin mRNA和Smac mRNA表達情況的比較
Livin α mRNA和Livin β mRNA在大腸癌組織中的表達明顯高于正常大腸組織(P<0.001),而Smac mRNA在大腸癌組織中的表達明顯低于正常大腸組織(P<0.001)。見表1。
表1 兩組Livin、Smac mRNA表達情況的比較(±s)
表1 兩組Livin、Smac mRNA表達情況的比較(±s)
組別 n Livin α mRNA Livin βmRNA Smac mRNA大腸癌組42 0.597±0.100 0.578±0.090 0.105±0.055正常組 22 0.123±0.083 0.127±0.070 0.563±0.067 F值 0.388 0.885 1.362 P值0.000 0.000 0.000
2.3 大腸癌組織中Livin與Smac表達的相關(guān)性分析 大腸癌組織中Livin蛋白與Smac蛋白共陽性表達15例,共陰性表達11例,僅Livin陽性13例,僅Smac陽性13例,二者表達呈負相關(guān)(r= -0.387,P <0.05)。并且,大腸癌組織中 Livin α、Livin β mRNA與 Smac mRNA表達也呈負相關(guān)(r=-0.493,P <0.05;r= -0.476,P <0.05)。
IAPs家族是一類獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白,均含有IAP同源序列(BIR)和RING指結(jié)構(gòu)域,能夠抑制細胞凋亡,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系〔3〕。Livin又稱腎IAP(KIAP),是新近發(fā)現(xiàn)的人類IAPs家族成員〔4〕,基因位于X染色體20q13.3,其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪切方式不同有兩種 mRNA亞型:Livin α和Livin β,分別編碼298和280個氨基酸的蛋白質(zhì),兩者除相差一段54 bp以外,其他完全一致〔5〕。Smac是目前發(fā)現(xiàn)的唯一存在于哺乳動物細胞中直接抑制IAPs的蛋白,在正常組織中分布較廣泛〔6〕。其前體存在于正常細胞線粒體中,在凋亡信號刺激下釋放至細胞質(zhì),經(jīng)修飾形成成熟的Smac。Smac可直接與Livin結(jié)合成Smac-Livin復合物,與半胱氨酸蛋白酶(caspase)競爭結(jié)合BIR結(jié)構(gòu),使Livin的BIR功能區(qū)失去活性,解除Livin的抑制作用,從而釋放活化的caspase而下調(diào)其抗凋亡活性〔7〕。
目前,Livin和Smac在大腸癌的表達及相互關(guān)系國內(nèi)外研究很少。國外研究顯示,Livin在很多人類惡性腫瘤中高表達,如黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌細胞系及結(jié)腸癌細胞系、非小細胞肺癌、前列腺癌細胞〔8〕。本研究結(jié)果顯示正常大腸組織中Smac表達顯著高于大腸癌組織,而大腸癌組織中Livin的表達顯著高于正常大腸組織,不僅從蛋白表達水平,還從mRNA表達水平證實了這一點。因此,預示Livin可作為一種新的腫瘤抗原來檢測胃腸道腫瘤,Livin有希望成為大腸癌發(fā)生早期階段的分子標記物和診斷指標。
Spearman等級相關(guān)分析顯示大腸癌組織中Livin蛋白與Smac蛋白表達呈負相關(guān)。Pearson相關(guān)分析從mRNA表達水平也證實了兩者的負相關(guān)性。這提示Livin和Smac的表達可能存在負反饋調(diào)節(jié)或者相互拮抗關(guān)系,可以推測Smac通過與Livin結(jié)合而抑制后者的抗凋亡活性,發(fā)揮促凋亡作用。是否還存在其他途徑發(fā)揮拮抗作用有待進一步的研究?,F(xiàn)已有研究證明將Smac cDNA轉(zhuǎn)染腎細胞癌細胞能提高其對促凋亡刺激的敏感性〔9〕,因而Smac對腫瘤的治療有重要作用。
Livin和Smac的表達關(guān)系可能是大腸癌細胞凋亡信號傳導通路中的重要環(huán)節(jié)。對Livin和Smac在大腸癌中相互關(guān)系的研究將有助于尋找IAP抑制劑,從而將促進腫瘤細胞凋亡發(fā)展為腫瘤治療的新靶點。
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R735.3
A
1005-9202(2011)12-2190-02
2010年江西省教育廳科技計劃項目青年項目(GJJ10204)
1 吉安市第三人民醫(yī)院
彭淑梅(1970-),女,實驗師,主要從事臨床實驗工作。
〔2011-02-11 收稿 2011-04-22 修回〕
(編輯 袁左鳴/徐 杰)