周洪偉，周曼，侯德巖，王玉蓉

(1．北京中醫(yī)藥大學，北京 100102;2．沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016)

人參皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1，以下簡稱Rg1)為四環(huán)三萜類衍生物，現(xiàn)代藥理研究表明，Rg1具有保護神經(jīng)元作用［1］，可改善老年動物衰退的行為活動功能［2］，增強阿爾茨海默病動物的學習記憶能力［3］。但Rg1易被腸道細菌所產(chǎn)生的酶降解，且在血液中消除快，直接口服生物利用度僅為1% ～20%［4］。脂質(zhì)體作為新型藥物載體，包封藥物后可防止藥物在腸道內(nèi)被酶降解，且脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)與細胞膜結(jié)構(gòu)類似，可增強藥物的跨膜吸收效果。效應(yīng)面優(yōu)化法(Response surface methodology，RSM)系通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而回推自變量取值范圍即最佳實驗條件，實驗設(shè)計可采用星點設(shè)計(Central composite design，CCD)，該方法適用于非線性模型擬合，且具有良好的預測性［5］。因此，本文擬采用CCD－RSM法優(yōu)化Rg1脂質(zhì)體的制備工藝。

1 儀器與試藥

HPLC系統(tǒng):LC－20AT四元泵、DGU－20A5脫氣機、CTO－10ASVP柱溫箱、SPD－20A紫外檢測器、SIL－20A自動進樣器、色譜工作站(日本島津公司)、Agilent eclipse XDB －C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);XL－90型超高速離心機(美國BeckMan);JEM－1230型透射電鏡(日本JEOL公司);RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BSII0S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號 110703－200726，純度:97．7%);人參皂苷Rg1藥品(購自上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%);二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC(Avanti公司，純度＞99%);膽固醇CH(Sigma公司，純度＞99%);豆固醇ST(MP公司，純度＞99%);甲醇、乙腈(色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2．1 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備Rg1脂質(zhì)體:精確稱取處方量磷脂、固醇(M∶M=2∶1)共溶于甲醇－氯仿混合溶劑中(V∶V=1∶9)，置250ml梨形瓶內(nèi)，于 40℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，待形成均勻的脂質(zhì)薄膜后，加入Rg1藥品水溶液，50℃水浴常壓旋轉(zhuǎn)水化60min，使脂質(zhì)薄膜充分溶脹，水化完全后超聲，即得Rg1脂質(zhì)體。

2．2 包封率的測定

2．2．1 色譜條件

色譜柱:Agilent eclipse XDB－C18柱(4．6mm ×250mm，5μm);流動相:乙腈:水 =20∶80;流速:

作者簡介:周洪偉(1982－)，男，北京中醫(yī)藥大學2009級中藥制藥學專業(yè)博士研究生，主要研究方向:中藥復方新型釋藥系統(tǒng)研究。

通訊作者:王玉蓉(1951－)，女，教授，博士研究生導師，主要研究方向:中藥復方新型釋藥系統(tǒng)研究。

收稿日期:2011－05－17

修回日期:2011－06－12

0.8mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:203nm;進樣體積:10μL。結(jié)果表明，該色譜條件下，輔料對人參皂苷Rg1的檢測無干擾，如圖1～3所示。

圖1 DPPC/CH空白脂質(zhì)體HPLC色譜圖

圖2 DPPC/ST空白脂質(zhì)體HPLC色譜圖

圖3 人參皂苷Rg1 HPLC色譜圖

2．2．2 標準曲線制作

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥36h的Rg1對照品2．53mg，置10mL量瓶中，精密加入甲醇至刻度，搖勻，定容，即得 Rg1對照品溶液 A。取 Rg1溶液A 1 000μL和100μL，分別置 10mL 量瓶中，精密加入甲醇至刻度，搖勻，定容，即得Rg1對照品溶液B和Rg1對照品溶液C。精密吸取Rg1對照品溶液A 1、2、4、6、8、10、12μL，對照品溶液 B 2、4、6、8、10μL，對照品溶液 C 3、6、18、21μL，分別注入色譜儀，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，得Rg1回歸方程:Y=455 220X－4 275．7(R2=1)。結(jié)果表明 Rg1在7．415～2 996.172ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．2．3 精密度試驗

取Rg1對照品溶液A，考察其日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果Rg1日內(nèi)RSD為0.35%(n=5);日間RSD為2.99%(n=5)，精密度符合要求。

2．2．4 回收率測定

按2．1項下方法制備空白脂質(zhì)體。分別精密加入45.2、22.6、11.3μg/mL 的 Rg1對照品溶液，制成高、中、低濃度的Rg1脂質(zhì)體混懸液，甲醇破乳后定容至2mL，按2．2．1項下方法測定Rg1含量，計算回收率。結(jié)果DPPC/CH脂質(zhì)體高、中、低濃度的回收率分別為(98.74±3.00)%、(95.72±3.20)%和(103.78±2.16)%，RSD分別為3.04%、3.34%、2.08%(n=3);DPPC/ST脂質(zhì)體高、中、低濃度的回收率分別為(96.19±0.95)%、(103.79±3.69)%和(100.74±5.75)%，RSD分別為0.99%、3.56%、5.70%(n=3)，回收率良好。

2．2．5 藥物純度測定

依2．1．1項下方法測定所購藥品 Rg1純度，得Rg1純度為99.15%，RSD=0.62%(n=3)，藥物滿足實驗要求。

2．2．6 包封率(EF%)測定方法

采用高速離心法測定Rg1脂質(zhì)體的包封率。精密量取 Rg1脂質(zhì)體適量，置超高速離心機中，4℃，130 000×g離心60min，取上清液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，超聲，依2．1．1項下方法測定上清液中Rg1的含量(W1)。另精密量取Rg1脂質(zhì)體5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，超聲，依2．1．1項下方法測定 Rg1的含量(W2)，按公式(1)計算包封率。

2．3 脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化

在預實驗基礎(chǔ)上，選擇Rg1藥物百分含量(%)X1、水化時間(min)X2和水化溫度(℃)X3為考察因素，以脂質(zhì)體包封率(Y)為指標進行CCD－RSM法優(yōu)化，X1范圍為1～10%，X2范圍為20～120min，X3范圍為30～70℃。實驗結(jié)果見表1～2。

表1 Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體CCD－RSM法優(yōu)化試驗結(jié)果表

續(xù)表1

表2 Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體CCD－RSM法優(yōu)化試驗結(jié)果表

采用Design－Expert 7．0軟件處理數(shù)據(jù)，對Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體，有:

直線回歸方程為:Y=0．13078+0．035565X1－0.000143865X2+0．0150133X3(R2=0．6670，P＜0.01)

二次回歸方程為:Y=0．25400+0．080565X1－0.0137274X2－ 0．0508121X3+0．0000491667X1X2+0.000330417

X1X3+0．0000728625X1X3－ 0．00590570X21－0.0000191762X22－ 0．00000335119X23(R2=0．8452，P＜0．05)

多元回歸方程為:

Y=0．99929 － 0．069587X1－ 0．016878X2－0.012206X3+0．00396612X1X2+0．000381720X1X3+0．000250289X2X3－0．00354414X21－0．00000516883X22－0.00000335119X23－0.0000322594X1X2X3－0.000177039X21X2+0.000200623X21X3－0.00000254679X1X22(R2=0.9058，P＜0.05)

由以上方程可知，多元回歸方程的擬合效果最好。采用OriginPro 8．0軟件繪制三維效應(yīng)面圖，考察X1、X2、X3三個因素對Y的影響，如圖4所示。

圖4 Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體效應(yīng)面圖

對Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體，有:

直線回歸方程為:Y=0．19373+0．028975X1+0.000496758X2+0．000789704X3(R2=0．6462，P＜0.01)

二次回歸方程為:

Y=0．55264+0．043245X1－ 0．00258731X2－0.010223X3+0．000393333X1X2+0．000121667X1X3+0．0000285X2X3－ 0．00435332X21－ 0．0000036019X22+0．0000834881X23(R2=0．8392，P＜0．01)

多元回歸方程為:

Y=0．59388+0．037897X1+0．00484306X2－0.020252X3－ 0．000782009X1X2+0．00165617X1X3+0．000189335X2X3－0．00470028X21－0．000119456X22+0．0000834881X23－0．0000292428X1X2X3－0.000028322X21X2+0．0000465899X21X3

+0．0000210645X1X22(R2=0．9354，P＜0．05)

由以上方程可知，多元回歸方程的擬合效果最好。采用Origin Pro 8．0軟件繪制三維效應(yīng)面圖，考察X1、X2、X3三個因素對Y的影響，如圖5所示。

圖5 Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體效應(yīng)面圖

2．4 最優(yōu)工藝驗證

由CCD－RSM法優(yōu)選Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體的制備工藝條件為:X1=7．4 ～8．1%，X2=50．0 ～85．0min，X3=60．0 ～63．0℃;Rg1/DPPC/ST 脂質(zhì)體的制備工藝條件為:X1=7．6 ～8．1%，X2=95．0 ～100．0min，X3=40．0～63．0℃。按優(yōu)選工藝分別制備Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體和Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體各3批，依2．2．1項下方法測定其包封率，結(jié)果見表3，數(shù)學模型滿足預測要求。

表3 脂質(zhì)體包封率驗證結(jié)果(n=3)

2．5 脂質(zhì)體粒徑分布測定與形態(tài)學考察

馬爾文動態(tài)光散射粒徑儀檢測脂質(zhì)體的粒徑分布。激光束波長633nm，入射與散射光束夾角173°，溫度25℃。取10μL脂質(zhì)體溶液用純凈水稀釋至1mL，混合均勻，置比色皿中測定。透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)。脂質(zhì)體適當稀釋后，滴于300目銅網(wǎng)表面，加入2%磷鎢酸溶液染色，染色完成后置透射電鏡中觀測。實驗結(jié)果見圖6～7。

圖6 Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體粒徑分布與電鏡圖

圖7 Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體粒徑分布與電鏡圖

由圖6～7可知，薄膜分散法制備的Rg1/DPPC/CH和Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體為多層脂質(zhì)體，其圓整度較好，可以滿足制備工藝要求。

3 討論

ST是植物細胞膜中的主要甾醇，與CH的結(jié)構(gòu)相似，有研究表明，ST對脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性要大于CH［6］，且能提高藥物的生物利用度［7］。本實驗同時制備Rg1/DPPC/CH脂質(zhì)體和Rg1/DPPC/ST脂質(zhì)體，并采用CCD－RSM法對脂質(zhì)體制備工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，兩種脂質(zhì)體包封率相近，提示可以ST代替CH作為Rg1脂質(zhì)體的膜材。

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