史 懷， 肖馬云， 劉 波

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

固定化細(xì)胞技術(shù)是指將微生物細(xì)胞、酶類(lèi)、抗體以及蛋白質(zhì)包埋在某些天然或有機(jī)合成材料形成的顆粒內(nèi)部的一種生物技術(shù)。經(jīng)固定化的細(xì)胞可在顆粒內(nèi)部增殖，免受苛刻環(huán)境條件的影響，在一定條件下能從顆粒內(nèi)部釋放出來(lái)[1]。固定化細(xì)胞憑借其優(yōu)良性能已被應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保、食品工業(yè)等領(lǐng)域。研究人員將某些聚合物包埋細(xì)菌制成微生物接種劑，應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，為開(kāi)發(fā)微生物菌劑的新載體探索出了一條新途徑[2-3]。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究顯示，包埋固定化的細(xì)菌肥料有保存期長(zhǎng)、不容易受環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，引起了廣泛關(guān)注。

淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus(Thom) Samson屬絲孢菌目擬青霉屬，對(duì)多種植物寄生線蟲(chóng)有著良好的防治效果，此外還具有殺蟲(chóng)、促長(zhǎng)、拮抗、降解等多種功效，是極具推廣潛力的生防菌與功能菌[4]。前人對(duì)淡紫擬青霉制劑的研究較多，但對(duì)淡紫擬青霉的固定化研究則尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)淡紫擬青霉的固定化包埋條件進(jìn)行了初步研究，旨在為淡紫擬青霉固定化微生物制劑工藝的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 淡紫擬青霉FJAT-9041菌株由本課題組自行分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 查氏培養(yǎng)基含3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖、1000 mL H2O，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 淡紫擬青霉FJAT-9041菌株于28 ℃、110 r·min-1搖床發(fā)酵7 d，孢子終含量為2.0×107cfu·mL-1。

1.2.2 固定化小球的制備 本試驗(yàn)選用4組材料進(jìn)行包埋，制備方法如下。

海藻酸鈉包埋：在4%海藻酸鈉中加入1/10體積的淡紫擬青霉發(fā)酵液，混合均勻后用10 mL注射器以恒定速度滴至10% CaCl2中。

聚乙烯醇包埋：在10%聚乙烯醇中加入1/10體積的淡紫擬青霉發(fā)酵液，混合均勻后用10 mL注射器以恒定速度滴至用NaCO3調(diào)節(jié)pH為6.7的含2% CaCl2的飽和硼酸中。

明膠包埋：將淡紫擬青霉發(fā)酵液與5-10 ℃的10%明膠按1∶1的比例混合均勻，用10 mL注射器以恒定速度滴至4% CaCl2中。

海藻酸鈉—明膠混合包埋：將淡紫擬青霉發(fā)酵液與2%海藻酸鈉、2%明膠按1∶1∶1的比例混合均勻，放入冰箱冷卻至5-10 ℃，用10 mL注射器以恒定速度滴至4% CaCl2中。

以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，獲得的固定化細(xì)胞小球在溶液中常溫固化2 h，無(wú)菌水洗滌后用無(wú)菌水浸泡置4 ℃下保存。

1.2.3 機(jī)械性能的測(cè)試 直徑的測(cè)量：隨機(jī)挑取20個(gè)固定化小球，用游標(biāo)卡尺測(cè)量直徑并計(jì)算平均值。

機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)量：分別用100 g砝碼加壓20個(gè)固定化小球，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)固定化小球的直徑并計(jì)算平均值。

檢驗(yàn)小球是否合格的方法：用100 g砝碼加壓不易破裂且無(wú)菌液流出；將固定化小球摔打在桌子上，很容易彈起，說(shuō)明合格。

1.2.4 活菌數(shù)的測(cè)定 保存7 d后，取1 g固定化小球，用0.2 mol·L-1無(wú)菌檸檬酸鈉溶液溶解，稀釋涂板，于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)淡紫擬青霉的活菌數(shù)，以淡紫擬青霉發(fā)酵液為對(duì)照。

1.2.5 包埋條件的優(yōu)化 固定其他條件不變，分別設(shè)置淡紫擬青霉發(fā)酵液含量為10%、15%、20%、25%、30%，海藻酸鈉含量為1%、3%、5%、7%、9%，CaCl2含量為8%、10%、12%、14%、16%，包埋時(shí)間1、2、3、4、5 h，進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，每個(gè)處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 淡紫擬青霉在固定化小球中存活能力的測(cè)定 固定化小球加少量無(wú)菌水置4 ℃的冰箱中保存，分別在10、30、60 d取樣，測(cè)定活菌數(shù)，以未固定化的淡紫擬青霉發(fā)酵液為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋材料的篩選

從表1、圖1可見(jiàn)：海藻酸鈉包埋形成的小球速度快，分散快，成球強(qiáng)度高；聚乙烯醇包埋的成球性能不好，形成的固形物不分散；明膠包埋不能成球；海藻酸鈉—明膠混合包埋可以成球，但小球聚合在一起不能分散開(kāi)來(lái)，呈團(tuán)狀。

2.2 活菌數(shù)

淡紫擬青霉在固定化小球中的初始活菌數(shù)為4.0×107cfu·mL-1，于4 ℃保存7 d后，用平板法測(cè)得的活菌數(shù)為2.25×107cfu·mL-1，對(duì)照為0.01×107cfu·mL-1。可見(jiàn)，淡紫擬青霉經(jīng)固定化后能顯著提高存活能力。

2.3 包埋條件的優(yōu)化

各處理對(duì)形成的淡紫擬青霉固定化小球的機(jī)械性能影響不大，各處理的初始活菌數(shù)為0.8×107cfu·g-1，對(duì)照為4.0×107cfu·g-1，存放7 d后的活菌數(shù)見(jiàn)表2。

比較各處理淡紫擬青霉的活菌數(shù)，最終得到優(yōu)化后的包埋條件為：淡紫擬青霉含量25%、海藻酸鈉含量4%、CaCl2含量12%、包埋時(shí)間2 h。

表1 包埋材料對(duì)淡紫擬青霉固定化小球性能的影響1)Table 1 Compare to different embing materials of the P.lilacinus with physics capability

1)-表示不能成球或形狀不規(guī)則，無(wú)此項(xiàng)數(shù)據(jù)。

A.海藻酸鈉; B.聚乙烯醇; C.明膠; D.海藻酸鈉—明膠。圖1 包埋材料對(duì)淡紫擬青霉包埋效果的影響Figure 1 Resuts of different embing materials on P.lilacinus

包埋時(shí)間/h活菌數(shù)×107 cfu·g-1淡紫擬青霉含量/%活菌數(shù)×107 cfu·g-1海藻酸鈉含量/%活菌數(shù)×107 cfu·g-1CaCl2含量/%活菌數(shù)×107 cfu·g-1125±3.51020±0.81-83±0.8265±2.31535±1.2311±1.81030±1.8350±2.52045±4.3535±1.21250±0.3445±1.52570±2.3725±3.31440±1.6550±3.2307±0.2910±2.3163±1.8

1)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；-表示不能形成固定化小球；CK的活菌數(shù)為0.02×107cfu·g-1。

2.4 淡紫擬青霉在固定化小球中的存活能力

從圖2可見(jiàn)，淡紫擬青霉在固定化小球中能夠很好地存活。保存30 d時(shí)，活菌數(shù)從最初的2.63×107cfu·g-1增加至22×107cfu·g-1，保存60 d時(shí)的活菌數(shù)依然有5.5×107cfu·g-1。而對(duì)照淡紫擬青霉發(fā)酵液中的活菌數(shù)一直下降，30 d時(shí)的活菌數(shù)僅為0.0002×107cfu·g-1，60 d時(shí)則無(wú)法分離到淡紫擬青霉菌。

圖2 海藻酸鈉固定化小球中淡紫擬青霉的存活動(dòng)態(tài)Figure 2 Survival dynamics of P.lilacinus in the immobilized cells

3 討論

將細(xì)胞固定化技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究開(kāi)始于20世紀(jì)80年代。熊春林等[5]采用海藻酸鈉包埋各種根瘤菌，測(cè)定根瘤菌在載體上和土壤中的存活情況，結(jié)果顯示，30 d內(nèi)有效活菌數(shù)一直增加，但之后菌數(shù)下降。李超敏等[6]將根瘤菌與光合細(xì)菌混合包埋制備微生物肥料的結(jié)果表明，固定化包埋顆粒能提高菌劑的有效期，微生物也能緩慢地從顆粒內(nèi)部釋放出來(lái)，有利于根瘤菌對(duì)大豆根部的侵染結(jié)瘤，盆栽試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。王梅等[7]研究表明，經(jīng)包埋的巨大芽孢桿菌的存活期比直接保存在菌液中的要長(zhǎng)很多，而且包埋在顆粒中的菌量還有一個(gè)緩慢的增加過(guò)程。

在固定化細(xì)胞載體方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較多的是將細(xì)胞包埋在海藻酸鈣、聚乙烯醇凝膠等作為載體形成的凝膠中加以固定[8]。在固定化條件的優(yōu)化方面，魯玉俠等[9]認(rèn)為，1 h為海藻酸鈉固定脂肪酸酶的最佳固定時(shí)間。吳定等[10]用海藻酸鈉固定酵母菌的結(jié)果表明：用2.5%海藻酸鈉包埋的成球性能、機(jī)械性能較好；用含量大于6%的海藻酸鈉包埋，發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力下降。王克明[11]以海藻酸鈉為載體包埋固定紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，其最佳的發(fā)酵條件為：細(xì)胞接入量20%、海藻酸鈉含量4%、CaCl2含量10%，此條件下的包埋效果較佳。

本試驗(yàn)對(duì)淡紫擬青霉的固定化方法進(jìn)行研究的結(jié)果表明，用海藻酸鈉包埋淡紫擬青霉的成球性能好，成球強(qiáng)度高。通過(guò)單因素試驗(yàn)得到海藻酸鈉固定淡紫擬青霉的最佳條件，將為下一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供良好基礎(chǔ)。

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