田瀟娜， 劉國(guó)紅， 劉 波， 林營(yíng)志

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002)

芽胞桿菌(Bacillus)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，能夠產(chǎn)生對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品具有強(qiáng)抗性的芽胞，能在多種不良環(huán)境下存活，分化形成具有特殊功能的菌株。因此，芽胞桿菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、科學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，為了更高效地利用芽胞桿菌資源，對(duì)芽胞桿菌系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究，對(duì)其分類鑒定方法進(jìn)行改進(jìn)就非常必要。

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，分子生物學(xué)方法在芽胞桿菌的分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用，如DNA-DNA雜交同源性分析、G+C含量分析、16S rRNA序列分析等。16S rRNA因進(jìn)化速率緩慢，基因產(chǎn)物功能保守，其序列分析是目前細(xì)菌的主要系統(tǒng)發(fā)育分類方法。但16S rRNA分子較小、包含的信息量也較少，對(duì)于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌一般分辨率較低，存在一定的局限性，只能大概在屬的水平上區(qū)分細(xì)菌，種水平的分類單元一般通過(guò)DNA-DNA雜交來(lái)鑒定。但DNA-DNA雜交不僅操作復(fù)雜，而且操作過(guò)程受很多因素影響，因此雜交結(jié)果不穩(wěn)定。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因進(jìn)行芽胞桿菌的鑒定越來(lái)越多，即以進(jìn)化速率不同的分子為研究對(duì)象，進(jìn)行芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。近年來(lái)，不斷有新的分子標(biāo)記基因被發(fā)現(xiàn)并使用。分子標(biāo)記基因可以反映生物個(gè)體或種群基因組中某種特異性DNA片段的差異，一般所選擇的靶基因主要分為2類，即非蛋白編碼基因與蛋白編碼基因，作為分子標(biāo)記應(yīng)具備的條件[1]為：基因普遍存在于各種細(xì)菌；對(duì)于特殊的生長(zhǎng)條件不顯示適應(yīng)性突變；不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。目前，使用最廣泛的非蛋白編碼基因?yàn)?6S rRNA基因序列分析，一般可以對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株進(jìn)行鑒定。蛋白編碼基因，可以同時(shí)從氨基酸和核酸水平2個(gè)信息系統(tǒng)進(jìn)行分析。如熱激蛋白(HSP)相關(guān)基因(hsp65、hsp70等)、重組蛋白基因(recA等)、延長(zhǎng)因子Tu基因、部分RNA聚合酶基因(rpoB、rpoD等)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的gyrB[2]等，對(duì)親緣關(guān)系較近的菌株的鑒定顯示了較大的優(yōu)越性。筆者主要闡述近年來(lái)使用較多的分子標(biāo)記基因gyrB、rpoB、gyrA等基因在芽胞桿菌分類鑒定中的應(yīng)用。

1 gyrB基因

1.1 gyrB基因的編碼蛋白及其功能

gyrB基因即促旋酶(gyrase)B亞單位基因，大小為2 kb的單拷貝持家基因，該基因高度保守，進(jìn)化較快，平均每5000萬(wàn)年單核苷酸堿基對(duì)變化1次。細(xì)菌DNA促旋酶由2種亞單位組成[3]，A亞基(gyrA)和B亞基(gyrB)，酶的活性結(jié)構(gòu)是2個(gè)A亞基和2個(gè)B亞基組成的四聚體，目前還沒(méi)發(fā)現(xiàn)兩者之間有連接體。其中B亞基是由gyrB基因編碼，分子量約90或70 kDa，具有DNA依賴的ATP酶活性，催化ATP的水解。DNA促旋酶屬于信息通路中與DNA復(fù)制、限制、修飾或修復(fù)有關(guān)的編碼蛋白。在大多數(shù)細(xì)菌中，以單拷貝的形式存在細(xì)菌基因組中，編碼的是唯一一種能誘導(dǎo)DNA負(fù)超螺旋的拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA促旋酶的B亞單位蛋白gyrB。它是一種細(xì)菌Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，在DNA復(fù)制及DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的維持過(guò)程中起著重要的作用。

1.2 gyrB基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

gyrB基因是目前細(xì)菌分類鑒定中系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記的典型代表。自從首次設(shè)計(jì)出通用引物并從許多革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌中成功擴(kuò)增出gyrB基因后，由于gyrB基因不顯現(xiàn)頻繁的基因橫行轉(zhuǎn)移，并且基于該基因的序列分析與DNA-DNA雜交的同源性分析有較好的一致性，gyrB基因在芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株鑒定中被廣泛使用，一般研究對(duì)該基因進(jìn)行測(cè)序或?qū)ζ銹CR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析。gyrB基因的進(jìn)化和細(xì)菌間的分子起源：分子系統(tǒng)研究的模式分子通過(guò)構(gòu)建gyrB和16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)展示了細(xì)菌間的進(jìn)化關(guān)系，證明了基于gyrB基因的進(jìn)化樹(shù)在決定沙雷氏菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化中比16S rRNA更可靠，16S rRNA在描述遠(yuǎn)源細(xì)菌間的關(guān)系中比較有用，而gyrB基因在細(xì)菌分子間和分子內(nèi)的系統(tǒng)分析中更具有參考價(jià)值。在枯草芽胞桿菌組的鑒定中[4]，通過(guò)對(duì)同組芽胞桿菌的16S rRNA序列及gyrB基因和DNA-DNA雜交基因的序列相似性進(jìn)行比較，gyrB基因的相似性與16S rRNA序列相比較低，而和DNA-DNA雜交有較好的一致性，可見(jiàn)gyrB基因可以作為枯草芽胞桿菌的有效地分類鑒定的方法。為了鑒定食物中的菌[5]，利用PCR技術(shù)結(jié)合限制性內(nèi)切酶技術(shù)，所選芽胞桿菌用Genebank中的引物對(duì)gyrB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用RsaI，Sau3AI和EcoRI等限制性內(nèi)切酶消化，論證了用gyrB基因特異性序列鑒別食物中蠟狀芽胞桿菌組的可能性。gyrB基因的PCR-Sau3AI指紋圖譜[6]也可以鑒定蘇云金芽胞桿菌，正如Yamada et al[7]報(bào)道的它避免了使用3種特殊的引物進(jìn)行菌株的鑒定。

基于gyrB基因的數(shù)據(jù)庫(kù)ICB[8]，為gyrB基因作為進(jìn)化和分類標(biāo)記提供了參考點(diǎn)和研究平臺(tái)。不僅包括菌株的核苷酸和氨基酸信息，可以進(jìn)行不同分類水平的序列比對(duì)，還提供菌株鑒定的引物選擇和背景信息。Bavykin et al[9]利用16S rRNA、23S rRNA和gyrB基因序列研究了蠟狀芽胞桿菌組的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)蠟狀芽胞桿菌組183株和74株菌分別進(jìn)行了16S rRNA和23S rRNA序列分析，并對(duì)30株經(jīng)過(guò)16S rRNA鑒定的該組菌進(jìn)行g(shù)yrB序列分析，結(jié)果蠟狀芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌3種基因序列分析都表現(xiàn)出異質(zhì)性，而炭疽芽胞桿菌表現(xiàn)出同源性，證明了gyrB基因序列分析可以把炭疽芽胞桿菌從蠟狀芽胞桿菌組中分離出來(lái)。Soufiane et al[11]在鑒定H血清型蘇云金芽胞桿菌時(shí)對(duì)16S rRNA，gyrB和aroE基因序列分析，3種基因都可以鑒定H血清型蘇云金芽胞桿菌，而gyrB和aroE基因顯示了極大的優(yōu)勢(shì)，但gyrB基因可以作為從H血清型蘇云金芽胞桿菌和同一血清型蘇云金芽胞桿菌中鑒定菌株的最佳標(biāo)記基因。基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜[11]作為一種蛋白分析鑒定細(xì)菌的工具，在短小芽胞桿菌的鑒定中對(duì)其功能的驗(yàn)證不僅利用16S rRNA基因進(jìn)行鑒定，更進(jìn)一步用gyrB基因進(jìn)行了鑒定。在鑒定新月紅色進(jìn)口火蟻中的芽胞桿菌時(shí)[12]gyrB基因與GenBank基因序列相比達(dá)到了95.48%到100%的匹配值，由此可見(jiàn)在芽胞桿菌鑒定中g(shù)yrB基因的使用是很廣泛的。

1.3 gyrA基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

gyrA即促旋酶(gyrase)的A亞單位基因，它和DNA促旋酶gyrB基因相連。A亞基由gyrA編碼，分子量約100 kDa，具有磷酸二酯酶活性，負(fù)責(zé)DNA斷裂和重接。由于其具有與gyrB基因類似的結(jié)構(gòu)和功能，因此可以作為菌株系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection， CICC)采用gyrA基因序列分析技術(shù)，對(duì)其保存的36株枯草芽胞桿菌菌群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到與16S rRNA基因序列分析一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，位于3個(gè)不同的系統(tǒng)發(fā)育分支間菌株的gyrA基因序列相似度在75.3%-95.3%之間，遠(yuǎn)低于16S rRNA基因序列相似度。gyrA基因序列分析對(duì)枯草芽胞桿菌群菌種的分辨率高于16S rRNA基因充分顯示了該基因用來(lái)鑒定芽胞桿菌的優(yōu)勢(shì)，因此有望成為工業(yè)用枯草芽胞桿菌菌種鑒定的一個(gè)有力工具。gyrA基因在其他相關(guān)芽胞桿菌的鑒定中也顯示了相對(duì)16S rRNA序列分析的優(yōu)勢(shì)及DNA-DNA雜交的一致性。

2 rpoB基因

2.1 rpoB基因的編碼蛋白及其功能

rpoB基因，編碼RNA聚合酶的β亞單位，被作為菌株鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化的標(biāo)記。基于rpoB基因的RT-PCR[13-14]已被用作鑒定蠟狀芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌，尤其在鑒別蠟狀芽胞桿菌組的炭疽芽胞桿菌中使用較多。部分rpoB基因序列，位于進(jìn)行RT-PCR的下游區(qū)域，它包括一段利福平耐藥性區(qū)段[15-16]，可以進(jìn)行炭疽、蠟狀、蘇云金、蕈狀和巨大芽胞桿菌等的基因型比較分析。韓國(guó)學(xué)者Ko et al[17]對(duì)炭疽芽胞桿菌及其近緣種蠟狀芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌的rpoB基因進(jìn)行了序列比較分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明炭疽芽胞桿菌分為單獨(dú)的一支，因此認(rèn)為rpoB基因可作為毒性炭疽芽胞桿菌的有效快速的鑒定方法。明膠產(chǎn)品的污染是目前備受人們關(guān)注的問(wèn)題，產(chǎn)品經(jīng)過(guò)高溫處理后仍存在細(xì)菌污染，Clerck et al[18]從明膠半成品提取物中分離到1129株菌，通過(guò)16S rDNA進(jìn)行初步篩選，再通過(guò)gyrA和rpoB序列的rep-PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，大多數(shù)菌株被鑒定為芽胞桿菌菌株。多項(xiàng)研究[19-20]均充分驗(yàn)證了rpoB基因在枯草芽胞桿菌組及其相關(guān)菌株的鑒定中是非常有效的。

2.2 rpoB基因在芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

2000年[21]基于rpoB基因的微生物群落分析就表明16S rDNA在種內(nèi)鑒定存在局限性。如今rpoB基因在醫(yī)學(xué)、臨床診斷和生態(tài)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面已被廣泛使用，一般結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和多項(xiàng)分析進(jìn)行研究。臨床上[22]使用rpoB基因檢測(cè)炭疽芽胞桿菌，根據(jù)復(fù)合探針熒光定量分析原理，以炭疽芽胞桿菌染色體上的rpoB基因?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)合成引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，該法檢測(cè)炭疽芽胞桿菌的靈敏度很高，能特異區(qū)分炭疽芽胞桿菌與其他蠟樣芽胞桿菌。rpoB基因[23]代替16S rDNA用來(lái)鑒定固氮類芽胞桿菌，可以結(jié)合多重PCR等技術(shù)把炭疽芽胞桿菌從蠟狀芽胞桿菌中分離出來(lái)。Meintanis et al[24]運(yùn)用REP-PCR和BOX-PCR技術(shù)對(duì)Geobacillus屬菌株及芽胞桿菌模式菌株的rpoB基因序列進(jìn)行了相似性分析，進(jìn)化樹(shù)分析表明rpoB基因序列相似性遠(yuǎn)低于16S rDNA序列相似性，因此，基于rpoB基因的REP-PCR和BOX-PCR技術(shù)可以進(jìn)行Geobacillus屬的分子分型，rpoB基因是Geobacillus屬優(yōu)于16S rDNA的準(zhǔn)確有效的鑒定方法。Ki et al[25]則將20株分離自海洋環(huán)境的芽胞桿菌通過(guò)16S rDNA序列比較,分為13個(gè)基因型和9個(gè)種，而基于rpoB基因的進(jìn)化樹(shù)是16S rDNA的4.5倍，說(shuō)明rpoB的基因多態(tài)性可以作為芽胞桿菌鑒定的標(biāo)記。為了克服16S rDNA 鑒定Geobacillus屬菌株的局限性，Weng et al[26]也通過(guò)recA和rpoB基因序列比較對(duì)Geobacillus屬菌株進(jìn)行了進(jìn)化分析和分子鑒定，rpoB基因序列分型顯示了更高的一致性，以此可以作為Geobacillus屬高效便捷的鑒定方法。

3 rpoD基因

枯草芽胞桿菌RNA聚合酶至少以5種聚合酶的形式存在[27]，尤其是在細(xì)胞內(nèi)每種酶對(duì)應(yīng)1種σ因子作為特異性啟動(dòng)子。RNA聚合酶的主要形式為43 000 Da的σ因子，是由rpoD基因編碼的，與大腸桿菌RNA聚合酶的主要σ因子同源?？莶菅堪麠U菌聚合酶σ43包括3個(gè)基因：P23，dnaE和rpoD(σ43)，3個(gè)基因緊密的連在一起。在細(xì)菌生長(zhǎng)的不同時(shí)期，2個(gè)重疊σ43啟動(dòng)子控制操縱子的表達(dá)，而σ37啟動(dòng)子在孢子形成時(shí)期調(diào)節(jié)操縱子的表達(dá)。rpoD基因處于aroD和lys基因之間，與dnaE基因相連，屬于crsA基因的一部分，其基因序列為acf-aroD-dnaE-rpoD(crsA)-spoOG-lys。rpoD基因的上游編碼區(qū)為dnaE基因，它編碼62 000 Da的蛋白，該蛋白對(duì)DNA復(fù)制是非常重要的，并且2個(gè)基因在染色體上為同方向逆時(shí)針轉(zhuǎn)錄，因此，rpoD基因的功能和結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的操縱子相似[28]。研究表明基于氨基酸序列合成的核酸探針在大腸桿菌和枯草芽胞桿菌中主要σ因子的合成中是非常保守的，可以用來(lái)鑒定不同真細(xì)菌的rpoD同源基因。在大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的假定編碼區(qū)和主要的σ因子區(qū)有13個(gè)氨基酸序列是非常普遍的，可以作為σ因子和主要σ因子的特征。這些基因被命名為hrdA，hrdB，hrdC和hrdD。據(jù)此設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)各種真細(xì)菌rpoD基因的同源性時(shí)顯示了很好的雜交信號(hào)。可見(jiàn)rpoD基因也是比較保守的，它特殊的結(jié)構(gòu)和功能決定了rpoD基因可以作為系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。rpoD基因在芽胞桿菌鑒定中應(yīng)用較少，Matsuura et al[29]在鑒定Erwiniaamylovora時(shí)對(duì)16S rRNA，gyrB和rpoD基因等分子標(biāo)記進(jìn)行了分析，證明了rpoD基因在細(xì)菌鑒定中的優(yōu)勢(shì)。

4 cry基因

蘇云金芽胞桿菌(Bt)制劑是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，其殺蟲(chóng)的主要活性成分是由殺蟲(chóng)蛋白基因(cry基因)編碼，并于營(yíng)養(yǎng)期或芽胞形成期產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICPs)。根據(jù)Crickmore et al[30]確立的新的分類規(guī)則，它們分別被確立為53個(gè)群、169類、386個(gè)亞類殺蟲(chóng)蛋白基因，因此cry基因家族成為蘇云金芽胞桿菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。趙銀娟等[31]從連云港海域中篩選出1株較有潛力的高活性Bt菌株，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，同時(shí)也用cry基因證實(shí)了該菌的特殊性?？莶菅堪麠U菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽胞桿菌和環(huán)狀芽胞桿菌是5種環(huán)保微生物制劑中常用的芽胞桿菌，針對(duì)這些菌的傳統(tǒng)理化檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，程琳琳等[32]建立了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，不僅使用GenBank上已有g(shù)yrB基因序列分別設(shè)計(jì)和篩選上述菌種的特異性引物，還利用rpoB、gdh系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記經(jīng)優(yōu)化建立了PCR快速有效檢測(cè)方法。炭疽芽胞桿菌含有毒性質(zhì)?；騪XO2，可以使細(xì)菌產(chǎn)生莢膜，pXO2上的cap基因在鑒定炭疽芽胞桿菌中已被使用，陳蘇紅等[33]為建立一種簡(jiǎn)便的炭疽芽胞桿菌檢測(cè)方法作臨床診斷工具，以pXO1質(zhì)粒上的pag基因及pXO2上的cap基因?yàn)榘袠?biāo)合成特異引物，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)目的產(chǎn)物，該法檢測(cè)炭疽的靈敏度很高，并且能區(qū)分炭疽芽胞桿菌與其它蠟樣芽胞桿菌。parE基因[34]為拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的編碼基因，可以對(duì)嗜熱菌Geobacillus屬的菌株進(jìn)行鑒定，作為管家基因在地衣芽胞桿菌組的鑒定中也被用作標(biāo)記基因。Hua et al[35]在16S rRNA鑒定的基礎(chǔ)上通過(guò)管家基因gyrB和parE分別驗(yàn)證了日本和敦煌2個(gè)地區(qū)枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌的同源性，證明了東亞北部黃土轉(zhuǎn)運(yùn)微生物事件。

5 討論

基因的系統(tǒng)發(fā)育分析在細(xì)菌分類鑒定中占有重要地位。隨著分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，DNA大規(guī)模測(cè)序得以進(jìn)行，傳統(tǒng)鑒定細(xì)菌的方法，在某些方面被一種可定量、較精確的以可翻譯核苷酸序列為基礎(chǔ)的分析方法所取代。因此，以核苷酸序列為基礎(chǔ)的分析，要求選擇合適的靶基因進(jìn)行比較分析。適合于系統(tǒng)發(fā)育研究的保守基因在其進(jìn)化過(guò)程中都面臨著巨大的選擇壓力，非編碼蛋白基因如16S rRNA基因與蛋白編碼基因相比，不同之處是在進(jìn)化過(guò)程中受到不同的約束條件，蛋白編碼基因由于密碼子的簡(jiǎn)并性，具有更大的變化，在細(xì)菌的鑒定中提供了更精確的信息，因此，在菌株分類鑒定中已被頻繁利用，gyrB、rpoB、gyrA和parE等基因在不同種芽胞桿菌的鑒定中各有優(yōu)勢(shì)?；诨蛐蛄袠?biāo)記的芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析等研究目前已廣泛展開(kāi)，但是，要想獲得更精確的分子標(biāo)記仍然需要不斷的研究和探索。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌基因序列的分析和比對(duì)逐漸變得較為容易，因此應(yīng)用分子標(biāo)記基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分類將不斷深入研究。

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