王蒙 徐志毅 高斐 馮星 錢麗娜 施錦

PCR檢測(cè)細(xì)菌16 s rRNA基因在臨床感染性疾病診斷中的應(yīng)用

王蒙 徐志毅 高斐 馮星 錢麗娜 施錦

目的建立檢測(cè)臨床常見細(xì)菌16 s rRNA基因的PCR方法。方法分析細(xì)菌16 s rRNA基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)通用引物對(duì)7種常見細(xì)菌16 s rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增;并用該方法檢測(cè)臨床血液標(biāo)本中的16 s rRNA基因表達(dá)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果7種標(biāo)準(zhǔn)菌株均出現(xiàn)特異陽(yáng)性條帶;感染性疾病血液標(biāo)本16 s rRNA基因陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論16 s rRNA基因PCR法可用于快速檢測(cè)臨床細(xì)菌感染。

聚合酶鏈反應(yīng);細(xì)菌;感染;16 s rRNA基因

快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出機(jī)體內(nèi)存在的病原菌是臨床診斷細(xì)菌性感染疾病的重要指標(biāo)，對(duì)疾病的及時(shí)、有效治療具有重大意義。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要使用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，一般所需時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性率不高，因此嚴(yán)重影響了疾病的診治。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)細(xì)菌感染，具有快速、準(zhǔn)確和特異的優(yōu)點(diǎn)，利于對(duì)疾病的快速診斷和及時(shí)治療。本研究建立了細(xì)菌16 s rRNA基因的PCR檢測(cè)方法，旨在提高感染性疾病的檢出率，以適應(yīng)現(xiàn)代臨床的需要。

1 材料與方法

1.1 材料 7種標(biāo)準(zhǔn)菌株(大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、傷寒沙門菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌)由本課題組教研室保存;臨床血液標(biāo)本40例，包括檢查確診的感染性病患血液標(biāo)本30例與健康者血液標(biāo)本10例。Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA marker等均購(gòu)自大連寶生物公司，引物由上海生工公司合成。ASTEC PCR擴(kuò)增儀(PC-818)，SYNGENE 凝膠成像系統(tǒng)(G:BOX)，Eppendorf高速離心機(jī)(5415R)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 采用細(xì)菌16 s rRNA基因高保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，上游引物 F:5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3'，下游引物R:5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為371 bp。

1.2.2 16 s rRNA基因的獲取 挑取單個(gè)菌落，加入50μl抽提裂解液，100℃煮沸10 min，12000 r pm離心 5 min，取上清作為PCR擴(kuò)增模板;抗凝血液標(biāo)本以500 rpm離心5 min，取血漿50μl，加入50μl抽提裂解液，處理步驟同上。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 將標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立檢測(cè)體系，PCR體系如下:模板2μl;上下游引物各1μl;10×Taq buffer(Mg2+plus)5μl;dNTPs Mix(10mmol/L)1μl;Taq酶(5 U/μl)0.5μl;ddH2O 39.5 μl;反應(yīng)體系總量為50μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸5 min。以同樣PCR體系條件擴(kuò)增檢測(cè)臨床血液標(biāo)本，將標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，并與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株16 s rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果 取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以DNA marker DL2000作標(biāo)準(zhǔn)分子量，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，見圖1。PCR擴(kuò)增后各菌株均在370 bp附近出現(xiàn)特異的目的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小吻合。

2.2 臨床血液標(biāo)本16 s rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果 血液標(biāo)本PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。臨床確診的細(xì)菌感染病患血液標(biāo)本均出現(xiàn)陽(yáng)性片段，擴(kuò)增的條帶與陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株(大腸埃希菌)的條帶片段大小一致;而健康者血液標(biāo)本與ddH2O的陰性對(duì)照結(jié)果未出現(xiàn)特異性條帶。

2.3 PCR法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 對(duì)40例臨床血液標(biāo)本分別進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)與PCR檢測(cè)，其中10例健康者血液標(biāo)本經(jīng)兩種方法檢測(cè)均為陰性。30例確診感染的病患標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)14例大腸桿菌陽(yáng)性、12例金黃葡萄球菌陽(yáng)性、4例陰性，陽(yáng)性檢出率86.7%;培養(yǎng)法檢出的26例陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)PCR檢測(cè)全部為陽(yáng)性，另有2例培養(yǎng)呈陰性的標(biāo)本經(jīng)PCR檢測(cè)后也呈陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率達(dá)93.3%。雖兩者比較未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＞0.05)，仍表明了PCR法的檢出率有高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的趨勢(shì)。

圖1 (左)7種標(biāo)準(zhǔn)菌株16 s rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2 (右)臨床血液標(biāo)本16 s rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

有關(guān)感染疾病的診斷問題是當(dāng)前臨床研究中的重點(diǎn)，引起感染的病原菌種類繁多，如何快速獲知為何種病原體感染，是臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)迫切需要解決的問題。一些致病菌的培養(yǎng)周期過長(zhǎng)、分離技術(shù)復(fù)雜以及使用抗生素治療等都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)面臨困難［1］，并且對(duì)于大量使用過抗生素的臨床標(biāo)本，傳統(tǒng)方法更不實(shí)用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以細(xì)菌16 s rRNA基因序列為基礎(chǔ)建立的PCR方法能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)臨床標(biāo)本中病原菌的感染。此種方法可早期判斷細(xì)菌感染的存在［2］，并通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的進(jìn)一步分析可對(duì)病原菌的種屬作出鑒定，因而彌補(bǔ)了上述檢測(cè)方法的不足，是感染性疾病診斷的一個(gè)重要突破口。

細(xì)菌的16 s rRNA基因序列具有高度保守性，被稱為細(xì)菌的“分子化石”［3］。本研究分析細(xì)菌16 s rRNA基因保守區(qū)并設(shè)計(jì)通用引物，通過PCR方法擴(kuò)增各種細(xì)菌的16 s rRNA基因片段，370bp處獲得特異性條帶。對(duì)于正常情況下無菌的組織和體液標(biāo)本(如血液、腦脊液等)，只要檢測(cè)出16 s rRNA基因片段的特異性表達(dá)，即確定有細(xì)菌感染。此種方法受抗生素影響小，無需在用藥前抽血［4］，整個(gè)PCR擴(kuò)增僅4～6 h即可完成，完全滿足臨床快速診斷的要求。因此與傳統(tǒng)的感染性疾病診斷方法相比，具有高效、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可診斷早期的細(xì)菌感染，為治療提供寶貴時(shí)機(jī)。

本研究對(duì)PCR快速檢測(cè)臨床感染疾病的體系建立進(jìn)行了初步探討。因16 s rRNA基因只存在于原核生物，不存在于病毒、真菌等非原核生物體內(nèi)［5］，故此方法只對(duì)于細(xì)菌性感染疾病的初步檢測(cè)具有臨床指導(dǎo)意義;而且對(duì)細(xì)菌種屬的鑒定還需進(jìn)一步分析，如序列測(cè)定等。另外，PCR操作過程中易因污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果［6］，因此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范無菌操作，并設(shè)立陰性對(duì)照，由此提高檢測(cè)結(jié)果的正確性和可靠性。

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上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項(xiàng)基金(項(xiàng)目編號(hào):yyz08001)

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