向建華，余彬華，雷 綾

（1.峨眉山市公安局 刑事技術(shù)室，四川 峨眉山 614200；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000）

有關(guān)損傷時間推斷的課題歷來都是法醫(yī)病理學(xué)者研究的熱點，尤其是顱腦損傷時間的推斷。腦挫裂傷（brain contusion，BC）是法醫(yī)學(xué)上常見的原發(fā)性閉合性／開放性腦損傷，它是指在顱腦受到暴力作用后而直接造成腦組織點片狀出血、水腫及壞死性變化的器質(zhì)性損傷。BC后可引起多種蛋白、細胞因子的改變。本研究通過大鼠建立腦挫裂傷模型，在不同時間點對腦損傷區(qū)、損傷周邊腦組織取材，并以陰性組和正常組作為對照，運用免疫組織化學(xué)方法檢測蛋白的動態(tài)變化，了解S100B標(biāo)記的膠質(zhì)細胞對腦挫裂傷的反應(yīng)，并以此來推斷腦外傷后所經(jīng)過的時間，探討其發(fā)生機制及其在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

健康、清潔的SD大鼠80只，雌雄不限，體重在250g左右，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。按照隨機的原則將大鼠分為實驗組、陰性對照組和正常對照組，其中實驗組又分為損傷后4h，12h，1d，3d，5d，7d，10d共7組，每組10只，正常對照組5只，陰性對照組5只。

1.2 主要試劑

濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；鼠SP通用型免疫組化染色試劑盒（美國ZYMED公司，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝）；鼠抗S100B單克隆抗體（博士德生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

（1）大鼠腦挫裂傷模型的建立。參照高燕、孫駿謨等［1］報道的方法，實驗大鼠用3%戊巴比妥鈉（0.12mL／100g）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定向儀上。消毒皮膚，頭皮正中切開，切口長2cm，剝離骨膜，暴露前囟和左頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后2mm、矢狀縫左側(cè)2mm處鉆一直徑5mm圓形骨窗，保持硬腦膜完整。將撞桿置于硬膜上，用20g砝碼20cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬腦膜，致左頂葉發(fā)生腦挫裂傷。打擊后切口內(nèi)滴注4萬單位硫酸慶大霉素4～5滴，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。陰性對照組僅開顱窗后用骨蠟封閉，不施加打擊。正常對照組不作任何處理直接處死取材。

（2）取材及標(biāo)本處理。分別于傷后相應(yīng)時間斷頸處死，取出全腦放入4%多聚甲醛中固定24h后，切取損傷區(qū)及其周邊區(qū)組織，常規(guī)組織連續(xù)切片，切片厚3μm，作HE染色及S100B蛋白免疫組織化學(xué)染色。

（3）免疫組織化學(xué)染色。具體步驟參照北京中杉公司SP試劑盒說明進行，以PBS液作陰性對照。

（4）顯微鏡觀察。在Olympus顯微鏡下觀察各組常規(guī)HE切片、S100B蛋白免疫組化切片。重點觀察免疫組化的著色范圍、強度情況。

（5）免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。S100B在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要由神經(jīng)膠質(zhì)細胞合成和分泌，特別是星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞；正常腦組織中僅有微量的S100B蛋白表達。如腦細胞胞漿中出現(xiàn)明顯的棕黃色染色應(yīng)判定為陽性表達。故根據(jù)神經(jīng)組織內(nèi)是否出現(xiàn)棕黃色顆粒及范圍半定性劃分等級為：細胞和間質(zhì)無染色或微染（1級）；細胞和／或間質(zhì)有染色，染色淺，呈小灶性（2級）；染色中等強度，呈斑片狀（3級）；染色深，呈廣泛分布（4級）。以PBS代替一抗作陰性對照的各切片均無棕黃色染色顆粒出現(xiàn)。

（6）圖像分析。采用北京天地公司TD2000真彩色圖像分析系統(tǒng)，對切片進行定性和半定量分析。在20×20倍鏡下，按照著色色調(diào)的一定閾值分割陽性細胞，每個點取5張片，每張片取連續(xù)不重復(fù)的10個視野，平均計數(shù)陽性細胞。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 11.0軟件包對所得數(shù)據(jù)進行分析，所得實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間的比較采用LSD法；同一時間點的實驗組與對照組比較采用配對t檢驗；以P＜0.05表示差異存在顯著性。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色

腦損傷后4h，損傷區(qū)及其周圍小血管和毛細血管擴張、淤血并見出血，組織水腫；神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞腫脹，胞核著色淺，部分神經(jīng)細胞核深染。傷后12h，損傷灶及其周圍神經(jīng)細胞皺縮、胞核固縮，尼氏體消失，胞漿呈嗜伊紅色；星形膠質(zhì)細胞腫脹，核固縮、碎裂或溶解，并出現(xiàn)炎性細胞浸潤。傷后1d，損傷灶周圍出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞。傷后3d，損傷區(qū)腦組織出現(xiàn)壞死，神經(jīng)細胞數(shù)量減少，并可見膠質(zhì)細胞增生。傷后7～10d，損傷區(qū)形成軟化灶。（見圖1、圖2）

圖1 傷后1dHE染色圖片

圖2 傷后3dHE染色圖片

2.2 免疫組化染色鏡下觀察

實驗組大鼠在腦損傷后4～12h，損傷區(qū)周圍即可見S100B蛋白表達增多，但著色較淺。損傷后1d，損傷區(qū)周圍開始出現(xiàn)較多的S100B蛋白表達，染色明顯加深。傷后3～5d，損傷區(qū)周圍有很明顯的S100B蛋白表達，染色較深。隨后逐漸減少，傷后10d陽性細胞數(shù)量與假手術(shù)組已無明顯差別。陽性細胞主要為損傷周圍星形膠質(zhì)細胞。各實驗組結(jié)果之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）（見表1、圖3、圖4）。陰性及正常組偶見S100B蛋白陽性細胞。

表1 免疫組化染色半定量測定S100B蛋白陽性細胞數(shù)

表1 免疫組化染色半定量測定S100B蛋白陽性細胞數(shù)

注：＊與陰性對照組比較P＜0.01；△與腦挫裂傷組傷后4h、12h、1d、7d、10d比較P＜0.01。

圖3 傷后1d免疫組化染色鏡圖片

圖4 傷后3～5d免疫組化染色鏡圖片

大鼠腦挫裂傷后S100B蛋白陽性細胞表達時序變化見圖5。

圖5 大鼠腦挫裂傷后S100B蛋白陽性細胞表達時序變化

3 討論

有研究表明，S100B蛋白不但是迄今最能反映顱腦損傷程度和預(yù)后的特異性蛋白［2］，而且在顱腦損傷后繼發(fā)性腦炎性損傷中扮演著重要的角色［3］。

S100B蛋白是神經(jīng)組織蛋白中的一種，為一種不含糖、脂和磷的酸性鈣結(jié)合蛋白，可溶解于pH7.0的飽和硫酸銨溶液，其基因定位于染色體1q21，而且其氨基酸序列在不同種屬中的一致性說明該蛋白具有重要功能。由α和β兩個亞單位以反向平行的方式組成同源二聚體（S100αα，S100ββ）或異源二聚體（S100αβ），形成S100αα、S100ββ、S100αβ三種組合形式，S100αβ和 S100ββ常被統(tǒng)稱為S100B蛋白［4］。S100B蛋白主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞、Schwann細胞以及某些神經(jīng)元、黑色素細胞、軟骨細胞和脂肪細胞中。腦內(nèi)生理量的S100B蛋白（3500mg／mg蛋白）主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，作用于神經(jīng)元及其生長環(huán)境，成為膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間相互作用的橋梁，主要具有以下功能［5］：①膠質(zhì)源性營養(yǎng)作用；②調(diào)節(jié)細胞的可塑性；③參與信息傳遞；④調(diào)節(jié)細胞代謝；⑤調(diào)節(jié)鈣離子濃度；⑥其他，促進胰島β細胞、垂體瘤細胞分泌胰島素和催乳素；參與炎癥反應(yīng)等。

但高水平的S100B具有神經(jīng)毒性：低濃度（1～10ng·mL－1）S100B保護培養(yǎng)的神經(jīng)元免于谷氨酸誘導(dǎo)的損害［6］，但高濃度（＞10ng·mL－1）可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞和培養(yǎng)的神經(jīng)元死亡。

本研究采用免疫組化染色法檢測S100B蛋白在大鼠腦挫裂傷后腦組織的表達，結(jié)果表明：大鼠腦挫裂傷后損傷周圍腦組織S100B蛋白水平在造模4～12h即開始增高，在傷后3～5d達到高峰，隨后逐漸下降，到傷后10d與對照組無明顯差別。引起S100B蛋白在顱腦損傷時分泌增加的機制可能有以下幾個方面：①腦挫裂傷后繼發(fā)炎性反應(yīng)，小膠質(zhì)細胞增生，分泌IL－1增多，IL－1能強烈刺激星形細胞活化和增殖，產(chǎn)生大量S100B蛋白，有研究表明：在體和離體實驗中IL－1能顯著上調(diào)S100B蛋白水平，使其升高較正常3倍以上［7］；②S100B蛋白自身液能促進星形膠質(zhì)細胞的肥大和增殖產(chǎn)生更多的S100B蛋白，從而形成正反饋調(diào)節(jié)（Positive feed back regulation）［8］；③其他炎性因子如IL－6、TNF－α、FGF－2、5－HT 對 S100B蛋白的表達亦有促進作用；④S100B蛋白的表達增加與凋亡的關(guān)系：神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的凋亡的發(fā)生可能促進S100B蛋白分泌增加，但目前尚無深入探討，需要進一步實驗予以證實。

綜上所述，大鼠顱腦損傷后S100B蛋白的表達具有一定的規(guī)律性，呈現(xiàn)出逐漸升高—高峰期—下降期的變化，其表達水平在傷后3～5d達到高峰。因此認(rèn)為S100B蛋白可作為法醫(yī)學(xué)顱腦損傷時間推斷的一個補充指標(biāo)。

［1］ 高 燕，孫駿謨，田志雄，等.大鼠自由落體腦外傷模型的制作［J］.浙江創(chuàng)傷外科，2004，9（5）：283.

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