李淑英

(河北省圍場(chǎng)滿族蒙古族自治縣醫(yī)院，河北 圍場(chǎng) 068450)

糖尿病微血管及大血管并發(fā)癥是患者致死、致殘的重要原因，如何減緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展是目前急需解決的問(wèn)題。低度炎癥反應(yīng)在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用受到人們的關(guān)注。白介素－6(IL－6)是炎癥反應(yīng)中重要的炎性細(xì)胞因子，也是誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生急性期蛋白的最主要的炎癥介質(zhì)。IL－6與胰島素抵抗(IR)、肥胖、2型糖尿病(T2DM)、冠心病等的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系［1］。

Jove M 等［2］體外研究發(fā)現(xiàn) 0.5mmoL/L 脂肪酸培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞其IL－6的分泌及表達(dá)均增加，脂肪酸還可引起葡萄糖載體－4(GLUT－4)的下降及胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取的減少，當(dāng)事先給予IL－6抗體培養(yǎng)后上述現(xiàn)象即消失，說(shuō)明脂肪酸可能通過(guò)升高IL－6的水平引起胰島素抵抗及T2DM的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)中我們觀察不同濃度的脂肪酸對(duì)脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響。

羅格列酮(RSG)屬噻唑烷二酮類(lèi)(TZDs)新型抗糖尿病藥物，通過(guò)激活PPAR－γ而增加肌肉、脂肪組織和肝臟對(duì)胰島素的敏感性而改善糖尿病。研究顯示［3］經(jīng)羅格列酮治療12周的糖尿病病人其升高的血清IL－6水平明顯下降，Lagathu C等［4］的研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可防止慢性IL－6處理的脂肪細(xì)胞所導(dǎo)致的IL－6分泌增多及胰島素抵抗。但羅格列酮是否可逆轉(zhuǎn)游離脂肪酸對(duì)脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響目前尚無(wú)定論，本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞水平加以研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)擬分離人成熟脂肪細(xì)胞(內(nèi)臟網(wǎng)膜和腹部皮下)，直接從體外觀察脂肪酸對(duì)脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響及RSG的干預(yù)作用，并比較脂肪酸及羅格列酮對(duì)糖尿病人與非糖尿病人脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響是否相同。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象與取材:實(shí)驗(yàn)所用患者內(nèi)臟網(wǎng)膜及腹部皮下脂肪取自外科住院進(jìn)行擇期開(kāi)腹手術(shù)的12例患者，住院原因分別為肝內(nèi)外疾病等。其中6例患者為非糖尿病患者，年齡32－56歲之間，BMI在21.1－24.9kg/m2之間，并除外肝、腎及其他內(nèi)分泌代謝疾病，入院一周內(nèi)無(wú)急性感染，無(wú)胰島素、TZDs、免疫抑制劑、激素、β腎上腺能受體激動(dòng)劑、兒茶酚胺等藥物應(yīng)用史。另外6例為糖尿病患者，糖尿病診斷按1999年WHO標(biāo)準(zhǔn)，并除外惡性腫瘤，肝、腎及其它內(nèi)分泌代謝疾病，心血管疾病，急性炎癥等，年齡35－60歲之間，BMI在21.3－26.2 kg/m2之間，患者術(shù)前皮下注射胰島素使空腹和餐后血糖均恢復(fù)正常3d以上(表中空腹及餐后血糖為手術(shù)前一日血糖)?；颊咭话阗Y料來(lái)源于圍場(chǎng)縣醫(yī)院。

1.2 主要試劑與器材:DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液(含L－谷氨酰胺和HEPES):美國(guó)，HYCLONE公司;胎牛血清白蛋白(BSA):上海，森雄公司;二甲基亞砜溶液(DMSO):由湘雅醫(yī)院病理生理實(shí)驗(yàn)室提供;PBS粉:美國(guó)，HYCLONE公司;RSG原粉:北京，高盟化工有限公司;脂肪酸:美國(guó) SIGMA公司;人IL－6ELISA檢測(cè)試劑盒:深圳，依諾金公司。

2 方法

2.1 脂肪酸對(duì)IL－6濃度影響的劑量曲線:細(xì)胞來(lái)源為非糖尿病人的內(nèi)臟網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞，脂肪酸作用濃度為 0.5mmoL/L，0.25mmoL/L，0.125mmoL/L，觀察時(shí)間為24h。各濃度脂肪酸干預(yù)下lnIL－6用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.2 RSG對(duì)脂肪酸介導(dǎo)的IL－6分泌的干預(yù)作用:細(xì)胞來(lái)源為非糖尿病人的內(nèi)臟網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞，RSG干預(yù)濃度為5umoL/L，10umoL/L(具體見(jiàn):含脂肪酸和RSG的聯(lián)合培養(yǎng)基的制備)，觀察時(shí)間為24h。各濃度RSG干預(yù)下lnIL－6用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.3 脂肪酸及RSG干預(yù)對(duì)糖尿病人脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響:細(xì)胞來(lái)源為糖尿病人內(nèi)臟網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞，脂肪酸濃度為0.5mmoL/L，RSG干預(yù)濃度為10umoL/L，觀察時(shí)間為24h。各組lnIL－6用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2.4 脂肪酸及RSG干預(yù)對(duì)糖尿病人及非糖尿病人IL－6分泌影響的比較:細(xì)胞來(lái)源為糖尿病及非糖尿病人內(nèi)臟網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞，脂肪酸濃度為0.5mmoL/L，RSG干預(yù)濃度為10umoL/L，觀察時(shí)間為24h。以脂肪酸培養(yǎng)分泌IL－6與基礎(chǔ)IL－6差值及脂肪酸培養(yǎng)分泌IL－6與RSG干預(yù)的差值取自然對(duì)數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，lnIL－6用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。細(xì)胞在含相同濃度DMSO和BSA的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，除藥物不同外，其余成分均相同。

2.5 人IL－6ELISA定量測(cè)定:人IL－6ELISA定量測(cè)定培養(yǎng)基中IL－6的濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析:用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 脂肪酸影響IL－6濃度的劑量效應(yīng):從圖1可以看出，脂肪酸對(duì)IL－6的分泌的促進(jìn)作用呈濃度依賴性，與對(duì)照組相比，0.125mmoL/L 脂肪酸、0.25mmoL/L脂肪酸和0.5mmoL/L脂肪酸培養(yǎng)下，IL－6分泌升高至對(duì)照組的107%、154%和202%。

3.2 RSG對(duì)IL－6分泌的影響:RSG對(duì)脂肪酸介導(dǎo)的IL－6分泌促進(jìn)作用具有逆轉(zhuǎn)作用，并與RSG的作用濃度有關(guān)。0.5mmoL/L脂肪酸使IL－6的分泌升高至對(duì)照組的202%，低濃度RSG干預(yù)后，IL－6濃度逆轉(zhuǎn)至對(duì)照142%，高濃度RSG干預(yù)可完全逆轉(zhuǎn)至對(duì)照組水平。隨機(jī)區(qū)組方差分析兩兩比較示脂肪酸組與對(duì)照組，脂肪酸組與聯(lián)合組之間P值均小于0.05(見(jiàn)表1)。

表1 6例非糖尿病患者分離的網(wǎng)膜(OT)脂肪細(xì)胞在不同濃度脂肪酸及RSG干預(yù)下培養(yǎng)24hIL－6的分泌(pg/mL)及l(fā)nIL－6值

3.3 脂肪酸及RSG干預(yù)對(duì)糖尿病人IL－6分泌的影響:脂肪酸對(duì)糖尿病人網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞分泌IL－6有促進(jìn)作用。若設(shè)定DM人脂肪細(xì)胞培養(yǎng)24h后基礎(chǔ)IL－6值為100%，則0.5mmoL/L脂肪酸培養(yǎng)的網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞分泌的IL－6為對(duì)照組的155%，高濃度RSG可完全逆轉(zhuǎn)脂肪酸引起的IL－6升高。隨機(jī)區(qū)組方差分析兩兩比較示脂肪酸組與對(duì)照組，脂肪酸組與聯(lián)合組之間P值均小于0.05(見(jiàn)表2)。

表2 6例糖尿病患者分離的網(wǎng)膜(OT)脂肪細(xì)胞在脂肪酸及RSG干預(yù)下培養(yǎng)24hIL－6的分泌(pg/mL)及l(fā)nIL－6值

3.4 脂肪酸及RSG干預(yù)對(duì)糖尿病人及非糖尿病人IL－6分泌影響的比較:從表3可以看出，脂肪酸及RSG干預(yù)對(duì)糖尿病及非糖尿病人IL－6分泌影響無(wú)明顯差異(P 值均 ＞0.05)。

圖1

3.5 脂肪酸影響IL－6濃度的劑量曲線。內(nèi)臟網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞在各種濃度的脂肪酸(0.125－0.5mmoL/L)中培養(yǎng)24h。對(duì)照組的細(xì)胞僅在含相同濃度的DMSO和BSA的培基中培養(yǎng)。各濃度脂肪酸干預(yù)下lnIL－6用6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表3 脂肪酸及RSG干預(yù)的DM及非DM人網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞分泌IL－6差值及l(fā)nIL－6比較

4 討論

4.1 脂肪酸對(duì)IL－6分泌的影響:我們以不同濃度的脂肪酸培養(yǎng)內(nèi)臟脂肪細(xì)胞24h來(lái)觀察脂肪酸對(duì)脂肪細(xì)胞分泌IL－6的影響。結(jié)果顯示脂肪酸有促進(jìn)脂肪細(xì)胞IL－6分泌的作用，且呈劑量依賴性，0.125mmoL/L脂肪酸、0.25mmoL/L脂肪酸和0.5mmoL/L脂肪酸培養(yǎng)下，IL－6分泌分別為對(duì)照組的107%、154%和202%。脂肪酸具有升高脂肪細(xì)胞IL－6分泌的作用，而IL－6為一種重要的炎性細(xì)胞因子充當(dāng)了脂肪組織內(nèi)能量代謝－內(nèi)分泌調(diào)節(jié)－炎癥反應(yīng)相互作用的媒介，降脂治療可能對(duì)降低IL－6水平及預(yù)防IL－6誘導(dǎo)的IR、T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有重大意義。

4.2 RSG對(duì)IL－6分泌的影響:在脂肪酸的培基中加入RSG后，IL－6的濃度下降，表明RSG可逆轉(zhuǎn)脂肪酸引起的IL－6分泌升高，并且逆轉(zhuǎn)作用的強(qiáng)弱與RSG濃度有關(guān)，5umoL/L的RSG聯(lián)合培養(yǎng)后，IL－6濃度下降至對(duì)照組142%，10umoL/L RSG可使IL－6完全降低至對(duì)照組水平。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RSG可逆轉(zhuǎn)脂肪酸引起的網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞IL－6的升高，即RSG有降低脂肪細(xì)胞IL－6分泌的作用。這與在體實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)論不一致，如Steven M等［6］給T2DM人服用RSG4－8mg/d連續(xù)26周血IL－6水平無(wú)明顯變化。RSG對(duì)IL－6影響在體內(nèi)外的差異可能是由于在活體內(nèi)RSG在降低脂肪細(xì)胞分泌IL－6的同時(shí)具有增加體重和肥胖的作用，而IL－6的分泌與BMI成正相關(guān)，離體實(shí)驗(yàn)可排除RSG的這種作用。

4.3 糖尿病人與非糖尿病人脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)IL－6分泌及脂肪酸和RSG干預(yù)效果的比較:我們的實(shí)驗(yàn)表明，10ummoL/LRSG能完全逆轉(zhuǎn)脂肪酸對(duì)IL－6分泌的促進(jìn)作用。而脂肪酸及RSG對(duì)DM人及非糖尿病人網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞的作用無(wú)明顯差異。脂肪酸及RSG對(duì)兩種人脂肪細(xì)胞的作用機(jī)制可能是相同的，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。IL－6可通過(guò)多種途經(jīng)導(dǎo)致IR，而本實(shí)驗(yàn)證實(shí)RSG可降低脂肪細(xì)胞IL－6水平，RSG可能通過(guò)降低IL－6的水平延緩IR及T2DM的發(fā)生，而對(duì)于已患T2DM者RSG可通過(guò)降低IL－6水平減少炎癥反應(yīng)及并發(fā)癥的產(chǎn)生。

［1］Dandona P，Aljada A，Bandyopadhyay A.Inflammation:the link between insulin resistance，obesity and diabetes［J］.Trends Immunol，2004，25(1):4 －7.

［2］Jove M，Planavila A，Carlos Laguna J，et al.Palmitate － Induced interleukin 6 production is mediated by protein kinase C and nuclear－factor kB activation and leads to glucose transporter 4 down － regulation in skeletal muscle cells［J］.Endocrinology，2005，146(7):3087 －3095.

［3］郭軍，周新麗.羅格列酮對(duì)2型糖尿病患者血清IL－6及CRP 表達(dá)的影響［J］.山東醫(yī)藥，2004，44(13):34－35.

［4］Lagathu C，Bastard JP，Auclair M，et al.Chronic interleukin－6 treatment increased IL－6 secretion and induced insulin resistance in adipocyte:prevention by rosiglitazone［J］.Biochem Biophys Res Connun，2003，311(2):372 －379.

［5］Steven M，Haffner，MD Andrew S，et al.Effect of rosiglitazone treatment on nontraditional markers of cardiovascular disease in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.Circulation，2002 ，106(6):679 －684.