王正巖 仇曉菲 李巖磊 苗亞靜 欒雅靜

小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)方法的優(yōu)化*

王正巖 仇曉菲△李巖磊 苗亞靜 欒雅靜

目的：探討優(yōu)化體外培養(yǎng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446腫瘤細(xì)胞球的方法。方法利用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)，觀察H446細(xì)胞在下述不同培養(yǎng)條件下腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng)情況，并接種于超低吸附及非超低吸附培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL，采用針頭吹打法和移液器吹打法將腫瘤細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液用以進(jìn)一步傳代。結(jié)果（1）超低吸附培養(yǎng)板第2天形成明顯腫瘤細(xì)胞球，非超低吸附培養(yǎng)板第10天出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞球。（2）1×106/mL組每個(gè)高倍視野下約有7個(gè)腫瘤細(xì)胞球，每個(gè)細(xì)胞球約由幾十個(gè)甚至上百個(gè)細(xì)胞組成。（3）針頭吹打法傳代后腫瘤細(xì)胞球活性和增殖能力明顯優(yōu)于移液器吹打法。結(jié)論選擇超低吸附培養(yǎng)板、1×106/mL密度接種和針頭吹打法可有效分離腫瘤細(xì)胞球。

肺腫瘤 癌,小細(xì)胞 細(xì)胞系,腫瘤 培養(yǎng)基,無(wú)血清 體外研究 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

腫瘤干細(xì)胞具有不斷自我更新和無(wú)限分化潛能，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥的根源。腫瘤干細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)條件下經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)等多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊，稱(chēng)為球體(spheres)[1]。目前有關(guān)小細(xì)胞肺癌體外干細(xì)胞培養(yǎng)的研究較少。體外腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)條件比較嚴(yán)格，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能影響腫瘤細(xì)胞球的形成及增殖。本實(shí)驗(yàn)探索了小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞球的培養(yǎng)技術(shù)，并選用不同培養(yǎng)板、不同接種密度和不同吹打方法進(jìn)行優(yōu)化比較，為研究小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞生物學(xué)特征提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自HyClone公司,甲基纖維素（methyl cellulose，MC）購(gòu)自Sigma公司，EGF和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購(gòu)自PeproTech公司，B27購(gòu)自Gibco公司,聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯（poly 2-hydroxyethyl methacrylate，polyHEMA）購(gòu)自Sigma公司，24孔板購(gòu)自天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司。

1.2培養(yǎng)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將H446細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L，置37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，備用。（2）無(wú)血清培養(yǎng)：無(wú)血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）由不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2%B27及0.7%甲基纖維素組成。甲基纖維素用去離子水配成20 g/L濃度溶液，使用前用2倍的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋制成0.7%甲基纖維素溶液。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H446細(xì)胞，用PBS液清洗，胰酶消化，重懸于SFM中并將細(xì)胞調(diào)整至1×106/mL，接種于24孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，早期采用分孔半量補(bǔ)液，即將24孔板中一孔腫瘤細(xì)胞懸液的半量體積分置于另一孔，再將兩孔分別補(bǔ)足標(biāo)準(zhǔn)量培養(yǎng)基。當(dāng)后期細(xì)胞球數(shù)量增多和體積變大時(shí)，低速（800 r/min）離心換液。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 為有效獲得大量腫瘤細(xì)胞球，本實(shí)驗(yàn)在以下3個(gè)方面進(jìn)行進(jìn)一步比較。（1）不同培養(yǎng)板實(shí)驗(yàn)：為了解不同培養(yǎng)板對(duì)腫瘤細(xì)胞球增殖情況的影響，設(shè)立超低吸附培養(yǎng)板組和非超低吸附培養(yǎng)板組，均按上述無(wú)血清培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)并觀察比較。其中，超低吸附培養(yǎng)板為常規(guī)24孔板用溶解在無(wú)水乙醇中的10 g/L poly HEMA溶液鋪2次，在超凈工作臺(tái)中風(fēng)干24 h備用。非超低吸附培養(yǎng)板即為未鋪poly HE?MA的常規(guī)24孔板。（2）不同接種密度實(shí)驗(yàn)：為了解不同接種密度對(duì)腫瘤細(xì)胞球增殖情況的影響，設(shè)立1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL及1×107/mL 4個(gè)接種密度組，均接種于超低吸附培養(yǎng)板內(nèi)，按上述無(wú)血清培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)并觀察比較。（3）不同吹打方法實(shí)驗(yàn)：為比較不同吹打方法對(duì)腫瘤細(xì)胞球增殖情況的影響，分別用1 000 μL移液器吹打法和5號(hào)針頭吹打法2種方法將細(xì)胞球吹打成單細(xì)胞懸液。再用上述無(wú)血清培養(yǎng)方法接種于超低吸附培養(yǎng)板內(nèi)，接種3 d,待培養(yǎng)孔中懸浮的腫瘤細(xì)胞球形狀規(guī)則、體積較大后，吸取含有細(xì)胞球的培養(yǎng)液，800 r/min離心3 min，棄上清，用移液器或帶5號(hào)針頭的無(wú)菌注射器重新吹打成單細(xì)胞懸液，按1∶2的比例傳代。在以上3組實(shí)驗(yàn)中，均每天于倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞球數(shù)量、大小和細(xì)胞折光度等指標(biāo)，并進(jìn)行腫瘤細(xì)胞球計(jì)數(shù)：每孔內(nèi)隨機(jī)取5個(gè)200倍視野分別計(jì)數(shù)，取其平均值記為此孔的腫瘤細(xì)胞球數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1不同類(lèi)型培養(yǎng)板對(duì)腫瘤細(xì)胞球形成及增殖的影響 采用超低吸附培養(yǎng)板，接種細(xì)胞24 h后，腫瘤細(xì)胞球形成，平均每個(gè)視野有8個(gè)細(xì)胞球，大小不一，每個(gè)細(xì)胞球所含細(xì)胞數(shù)達(dá)數(shù)十個(gè)至上百個(gè)，呈圓形、卵圓形或桑葚狀，懸浮生長(zhǎng)，折光性好，細(xì)胞之間連接緊密，見(jiàn)圖1A；采用非超低吸附培養(yǎng)板，接種細(xì)胞48 h后大部分細(xì)胞貼壁呈梭形生長(zhǎng)，少部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第10天有腫瘤細(xì)胞球形成，平均每個(gè)視野有3個(gè)細(xì)胞球，每個(gè)細(xì)胞球約由10個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，見(jiàn)圖1B。

2.2不同接種密度對(duì)腫瘤細(xì)胞球形成及增殖的影響 按1×104/mL和1×105/mL密度接種，第3天觀察有腫瘤細(xì)胞球形成，數(shù)量較少，平均每個(gè)視野有3個(gè)球體，直徑較小，大約由4～5個(gè)細(xì)胞組成，見(jiàn)圖1C；按1×106/mL密度接種，第2天即有明顯腫瘤細(xì)胞球形成，平均每個(gè)視野有7個(gè)球體，細(xì)胞球體積大小不一，每個(gè)球體所含細(xì)胞數(shù)有幾十個(gè)甚至上百個(gè)，細(xì)胞球致密均一，折光性良好，呈懸浮生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1D；按1×107/mL密度接種，第2天有細(xì)胞球形成，平均每個(gè)視野有5個(gè)球體，每個(gè)細(xì)胞球約由幾十個(gè)細(xì)胞形成，細(xì)胞球懸浮生長(zhǎng)，但貼壁分化生長(zhǎng)細(xì)胞較多，且出現(xiàn)數(shù)個(gè)較大的連接松散的黏附細(xì)胞團(tuán)。

2.3不同吹打方法對(duì)亞代腫瘤細(xì)胞球形成的影響 采用針頭吹打法，細(xì)胞球能很好地分散開(kāi)，形成單細(xì)胞和部分小細(xì)胞球。傳代后第3天亞代腫瘤細(xì)胞球出現(xiàn)，平均每個(gè)視野有8個(gè)球體，每個(gè)細(xì)胞球約由40個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞球折光性良好，連接緊密，以圓形居多，與原代細(xì)胞球無(wú)明顯差別；采用移液器吹打法，細(xì)胞球不能很好地分散開(kāi)，形成少部分單細(xì)胞和較多大細(xì)胞球，傳代后第3天腫瘤細(xì)胞球折光性差，中央有細(xì)胞死亡，平均每個(gè)視野有4個(gè)細(xì)胞球，每個(gè)細(xì)胞球約由20個(gè)細(xì)胞組成。

3 討論

目前關(guān)于肺癌腫瘤干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)仍存在爭(zhēng)議。長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，含EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基有利于正常干細(xì)胞體外擴(kuò)增[2]。Eramo等[3]在含EGF和bFGF的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)富集了肺癌干細(xì)胞球。Levina等[4]將非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和A549細(xì)胞在含EGF、bFGF和胰島素的0.8%甲基纖維素培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，獲得了大量富含腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞球。Bertolini等[5]用含EGF、bFGF和B27的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)得到了肺癌干細(xì)胞球。本實(shí)驗(yàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)添加了EGF、bFGF和B27添加劑，并且有效地分離了腫瘤細(xì)胞球?？紤]原因?yàn)镋GF和bFGF促進(jìn)了細(xì)胞有絲分裂和抑制細(xì)胞分化，B27作為血清替代物，既保留了細(xì)胞賴(lài)以生存的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，又去除了血清中的促分化劑。

惡性上皮腫瘤呈貼壁生長(zhǎng)，一旦阻止其貼壁，癌細(xì)胞便迅速凋亡，這種細(xì)胞凋亡方式稱(chēng)為anoikis[6]。腫瘤干細(xì)胞具有anoikis抗性，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，經(jīng)EGF和FGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，干細(xì)胞可以形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球體。為了提高細(xì)胞球的形成率，本實(shí)驗(yàn)采用低黏附物質(zhì)polyHEMA鋪板制備超低吸附培養(yǎng)板。與非超低吸附培養(yǎng)板相比較，不僅腫瘤細(xì)胞球出現(xiàn)較早，而且細(xì)胞球數(shù)量多且體積大，考慮原因可能為超低吸附培養(yǎng)板促使分化的細(xì)胞因不能貼壁生長(zhǎng)而加快了凋亡。本實(shí)驗(yàn)還采用半固體甲基纖維素培養(yǎng)基，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而有效促進(jìn)了單細(xì)胞克隆球的形成。

腫瘤干細(xì)胞增殖所具備的條件包括細(xì)胞分裂模式、細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)和微環(huán)境。細(xì)胞自分泌或旁分泌的分泌因子和細(xì)胞間的相互作用是維持微環(huán)境的重要因素。本研究結(jié)果表明，1×106/mL的細(xì)胞接種密度是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞球增殖的最佳密度；1×104/mL和1×105/mL的接種密度中，細(xì)胞多保持單細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞增殖速度較慢，考慮原因可能是培養(yǎng)體系中腫瘤干細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量小，能進(jìn)行對(duì)稱(chēng)分裂增殖的細(xì)胞數(shù)量少，且細(xì)胞間自分泌和旁分泌所形成的分泌因子作用薄弱，致使細(xì)胞不能大量增殖；而1×107/mL接種密度下，出現(xiàn)大量細(xì)胞貼壁和細(xì)胞黏附成團(tuán)現(xiàn)象，并且早期大量細(xì)胞死亡。以上結(jié)果提示，接種密度過(guò)大易使細(xì)胞重聚成團(tuán)致中心細(xì)胞死亡，貼壁細(xì)胞的分化又進(jìn)一步促進(jìn)了重聚細(xì)胞團(tuán)的分化，導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞成球效率并不能提高。在腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)的換液過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)早期采用分孔半量補(bǔ)液方法，待后期細(xì)胞球數(shù)量增多和體積變大時(shí)過(guò)渡到離心換液，既保留部分原來(lái)的微環(huán)境，又避免早期離心對(duì)細(xì)胞的損害，有效地增加了腫瘤細(xì)胞球的數(shù)量。在腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)的傳代過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)采用針頭吹打法效果優(yōu)于移液器吹打法。由于細(xì)胞增殖形成的腫瘤細(xì)胞球結(jié)合非常緊密，用1 000 μL移液器吹打時(shí)不能將細(xì)胞球有效分散，導(dǎo)致中央細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)滲透障礙而發(fā)生凋亡現(xiàn)象；使用針頭吹打法，細(xì)胞球能較好地分散開(kāi)，形成單細(xì)胞和少量小細(xì)胞球，其亞代克隆具有很強(qiáng)的增殖和傳代能力，故傳代時(shí)針頭吹打法制備單細(xì)胞懸液是較好選擇。但是在采用針頭吹打法時(shí)應(yīng)掌握好吹打力度及次數(shù)，盡量輕柔，避免產(chǎn)生氣泡，不可無(wú)限增加吹打次數(shù)，吹打的次數(shù)保持5次左右較好，以形成大量單細(xì)胞和少量小細(xì)胞球的懸液即可。

綜上，為有效獲得腫瘤細(xì)胞球，使用甲基纖維素培養(yǎng)基和超低吸附培養(yǎng)板是必要的，1×106/mL是最佳接種密度，傳代時(shí)制備單細(xì)胞懸液采用針頭吹打法較好。

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Optimization of the Method to Culture Tumor Cell Spheres in Human Small Cell Lung Cancer Cell Line H446

WANG Zhengyan,QIU Xiaofei LI，Yanlei,MIAO Yajing，LUAN Yajing

Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To optimize the method to culture the tumor cell spheres in small cell lung cancer(SCLC)cell line H446 in vitro.Methods:Using the serum-free culture technology,the growth situation of the H446 tumor cell spheres was observed in different culture conditions.The cells were inoculated to ultra low adherent plates and non-ultra low adher?ent plates.The cell density was adjusted to 1 ×104/mL,1×105/mL,1×106/mL and 1×107/mL.The cell spheres were blown in?to single cells through micropipette blow method and pinhead blow method in order for further passages.Results:（1）In ultra low adherent plates,the tumor spheres appeared clearly at the second day,while in the tenth day in non-ultra low adherent plates.（2）At the concentration of 1×106/mL,there were about seven spheres per high power field and dozens of cells even hundreds of cells for each sphere.（3）In the pinhead blow method,the tumor spheres showed better activity and proliferative ability in second generation.Conclusion:The tumor spheres can be separated effectively by ultra low adherent plate,the in?oculum density of 1×106/mL and the pinhead blow method.

lung neoplasms carcinoma,small cell cell line,tumor culture media,serum-free in vitro cell cul?ture techniques

*天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：09JCZDJC20300）作者單位：300070 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室

△通訊作者 E-mail:qiouxf@tijmu.edu.cn

（2010-06-28收稿 2010-09-08修回）

（本文編輯 陸榮展）