鄭金國 高淑萍 葛利軍 鄧新桃 何永輝 石桂良 潘 閩

心房顫動與白介素-6-174G/C、-572C/G、-597G/A位點基因多態(tài)性的關(guān)系*

鄭金國 高淑萍 葛利軍 鄧新桃 何永輝 石桂良 潘 閩△

目的：探討江蘇南通地區(qū)漢族人群中白細(xì)胞介素（IL）-6-174G/C(rs1800795)、-572C/G(rs1800796)、-597G/A(rs1800797)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與血清IL-6水平以及房顫發(fā)病之間的關(guān)系。方法分別測定房顫組和對照組血清IL-6及其他臨床指標(biāo)，測量左心房長徑(LAD)；提取基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)擴增目的基因片段并酶切。結(jié)果房顫組IL-6和LAD與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)；房顫組IL-6-572C/G基因型分布G/C+G/G明顯高于對照組(P﹤0.05)，且房顫組G等位基因頻率明顯大于對照組(P﹤0.01)，IL-6-174G/C位點C等位基因突變率極低，IL-6-597G/A未見A等位基因突變。結(jié)論IL-6-572C/G位點G等位基因突變導(dǎo)致了機體血清IL-6水平升高，可能與房顫的發(fā)病有關(guān)。

心房顫動 炎癥 白細(xì)胞介素6 多態(tài)性,單核苷酸 多態(tài)性,限制性片段長度 脂類

心房顫動是臨床實踐中最常見的心律失常，其病因除了傳統(tǒng)的冠心病、高血壓及瓣膜病外，一些新的危險因素如炎癥正日益成為研究的焦點[1-3]。炎癥因子基因啟動子區(qū)多態(tài)位點可通過對其下游基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控影響其表達(dá)，對相應(yīng)炎癥因子的血清濃度及有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[2]。本研究從遺傳學(xué)角度探討炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）-6及其基因多態(tài)性與房顫發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 127例房顫患者為2008年7月—2008年12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院住院或體檢者（房顫組），房顫的診斷及分類按2006年ACC/AHA/ECS制定的標(biāo)準(zhǔn)，并排除合并感染或非感染性炎癥性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病以及急性冠脈綜合征患者。同期南通大學(xué)附屬醫(yī)院體檢的109例竇性心律者為對照組，經(jīng)病史詢問及心電圖證實未發(fā)生過房顫。

1.2方法

1.2.1血壓及左心房長徑(LAD)測定 連續(xù)3 d測房顫患者坐位3次右臂血壓，取其平均值；體檢人群連續(xù)隨訪3 d測量3次坐位右臂血壓并取均值。西門子SEQUOIA/512心臟彩色多普勒超聲在胸骨左緣長軸端面測量患者左房長軸最大內(nèi)徑，共測3次取其平均值。

1.2.2血清IL-6及血脂水平檢測 空腹非抗凝外周靜脈血4 mL，分離血清后酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法測定IL-6含量。Olympus 2000全自動生化分析儀檢測患者總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.3基因組DNA提取及PCR擴增 空腹抗凝外周靜脈血2 mL，上海生工試劑盒提取基因組DNA作為模板,PCR擴增包括IL-6啟動子-174G/C、-572C/G、-597G/A位點等位基因在內(nèi)的617 bp片段。引物序列：上游5′-AGTGGGCTGAAGCAG?GTGA-3 ′下 游 5′-CTTTGTTGGAGGGTGAGGG-3 ′。50 μL PCR反應(yīng)體系于Marstercycler gradient擴增儀中經(jīng)94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40個循環(huán)后72℃充分延伸10 min后，4℃保存；限制性內(nèi)切酶NlaⅢ、BsrB1、Fok1分別對IL-6-174、-572、-597位點酶切，酶切產(chǎn)物分別做瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)觀察帶型并拍照。PCR產(chǎn)物送上海生工進行雙向測序。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件包處理數(shù)據(jù)。連續(xù)變量用表示，2組間比較用t檢驗。計數(shù)資料以%表示，組間比較用檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1房顫組與對照組基本臨床資料比較 2組年齡、性別、高血壓、TG、HDL-C、LDL-C、BMI和白細(xì)胞計數(shù)（WBC）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，IL-6、LAD、TC、冠心病、糖尿病差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 房顫組與對照組臨床資料比較

2.2IL-6啟動子區(qū)3個位點的基因多態(tài)性分析 （1）-174G/C位點：2組中可見G/G和G/C 2種基因型。房顫組G/G、G/C型頻率分別為98.43%、1.57%，對照組G/G、G/C型頻率分別為97.25%、2.75%，未檢測到C/C型，G→C等位基因突變頻率極低。（2）IL-6-597位點：結(jié)果中未見-597位點G→A基因的突變。（3）-572C/G位點：2組均可見3種基因型，見圖1；測序結(jié)果見圖2、3。經(jīng)檢驗，符合Har?dy-Weinberg平衡，具有群體代表性（房顫組=0.066，對照組=0.002，均P>0.05）。2組基因型頻率和等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。房顫組C/G+G/G基因型血清IL-6、TC水平與C/C基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TG、HDL-C、LDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義；對照組C/G+G/G基因型和C/C基因型各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3、4。

圖1 IL-6-572C/G位點酶切后電泳圖（Marker為DL 5 000）

圖2 IL-6-572C/G位點突變型測序圖譜

圖3 IL-6-572C/G位點野生型測序圖譜

3 討論

慢性炎癥可能貫穿房顫的發(fā)生發(fā)展全過程。目前房顫發(fā)病的分子機制仍不明確，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與房顫的易感性有很大相關(guān)性，遺傳基因在房顫發(fā)病中也可能起重要作用[2]。并在離子通道基因、連接蛋白基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)基因的SNP研究中得到了證實[4]。

表2 2組IL-6-572C/G基因頻率比較 （例）

表3 房顫組IL-6-572C/G各基因型間IL-6及血脂水平比較

表3 房顫組IL-6-572C/G各基因型間IL-6及血脂水平比較

基因型 n IL-6(ng/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C/C C/G+G/G t 65 62 328.81±122.70 340.01±124.91 8.32*3.27±1.12 4.07±0.94 6.75*1.37±0.69 1.29±0.78 0.36 1.36±0.34 1.31±0.37 0.12 2.34±0.83 2.19±0.62 0.78

表4 對照組IL-6-572C/G各基因型間IL-6及血脂水平比較

表4 對照組IL-6-572C/G各基因型間IL-6及血脂水平比較

均P>0.05

基因型 n IL-6(ng/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C/C C/G+G/G t 73 36 110.55±41.86 117.76±47.34 0.59 2.56±0.87 2.71±0.93 0.34 1.15±0.81 1.12±0.75 2.06 1.26±0.47 1.30±0.57 0.52 2.29±0.69 2.16±0.52 0.29

SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病(尤其是多基因疾病)易感性和藥物反應(yīng)性差異的核心信息。炎癥因子基因啟動子區(qū)多態(tài)位點可通過對其下游基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控從而影響其表達(dá)，對相應(yīng)的炎癥因子血清濃度產(chǎn)生影響，進一步影響有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。IL-6作為體內(nèi)炎癥標(biāo)志物的代表，其水平也受相應(yīng)基因調(diào)控。有報道認(rèn)為IL-6啟動子區(qū)的-174G/C和-572C/G位點的SNP可調(diào)整體內(nèi)IL-6的表達(dá)[5]。

本研究中房顫組IL-6血清水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示IL-6血清水平可能與房顫發(fā)病有關(guān)。該地區(qū)人群中IL-6-174G/C位點C等位基因突變極少，IL-6-597G/A位點未見A基因突變，與歐美研究差異較大[5]，可能與人種有關(guān)。房顫組IL-6-572C/G位點G等位基因頻率及C/G+G/G基因型分布明顯高于對照組，C/G+G/G組血清IL-6、TC水平與C/C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可見IL-6-572C/G位點突變的G等位基因可能通過基因調(diào)控促進IL-6的高度表達(dá)，使血清IL-6水平升高，使機體處于高炎癥狀態(tài)。IL-6作為炎癥反應(yīng)的中樞性調(diào)節(jié)者，可促進心肌細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、增強中性粒細(xì)胞和心肌細(xì)胞的黏附作用，促進中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，使心肌細(xì)胞損傷[6]。IL-6可激活基質(zhì)金屬蛋白酶-2[7]，基質(zhì)金屬蛋白酶則參與了房顫的心房重塑過程[8]，同時心房肌的炎癥反應(yīng)亦可直接影響膜電位的變化[9]，進而引起心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)，增加房顫的發(fā)病風(fēng)險?？梢娧装Y因子及其啟動子區(qū)基因多態(tài)性與房顫的發(fā)病可能存在一定的相關(guān)性[2]，IL-6-572C/G位點G等位基因可能是該地區(qū)房顫發(fā)病的遺傳易感基因。IL-6濃度及其多態(tài)位點基因分型檢測能在一定程度上預(yù)測房顫發(fā)病風(fēng)險，并可為房顫防治提供新途徑。

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Relationship between Atrial Fibrillation and the IL-6-174G/C，-572C/G and-597G/A Polymorphism

ZHENG Jinguo,GAO Shuping,GE Lijun,DENG Xintao,HE Yonghui,SHI Guiliang,PAN Min

Department of Cardiology,People’s Hospital of Xinghua City,Jiangsu 225700，China

Objective:To explore the relationships among atrial fibrillation(AF),interleukin-6(IL-6)and single nucle?otide polymorphisms(SNP)of the IL-6-174G/C,-572C/G and-597G/A.Methods:The serum levels of IL-6,lipid and oth?er clinical indicators were measured.The left atrial diameter(LAD)was measured by echocardiography(UCG).The frequency distributions of genotypes and alleles of the IL-6-174G/C,-572G/C and-597G/A were amplified by polymerase chain reac?tion-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)in samples of 127 AF patients.Results:The values of IL-6 and LAD were significantly higher in AF group than those of control group(P<0.01).The G/C+G/G genotype distribution and G allele frequencies of IL-6-572C/G were significantly higher in AF group than those of control group(P<0.01).The C allele mutation rate of IL-6-174G/C was minimal in Han population in Jiangsu Nantong,and no A allele mutation in IL-6-597G/A.Conclusion:The results showed that among Han population in Nantong IL-6-572 C/G polymorphic allele G mutation may lead to the increase of serum level of IL-6 in AF group，which may be related to the pathogenesis of AF.

atrial fibrillation inflammation interleukin-6 polymorphism,single nucleotide polymorphism,restriction fragment length lipids

*寧夏自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：NZ10168）；南通市社會發(fā)展項目（項目編號：S40015）

225000 江蘇省興化市人民醫(yī)院心內(nèi)科ICU（鄭金國，鄧新桃，何永輝，石桂良）；寧夏自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科（高淑萍，葛利軍）；南通大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科（潘閩）

△通訊作者 E-mail:panmin6666@yahoo.com.cn

(2010-06-11收稿 2010-08-03修回)

（本文編輯 李國琪）