張偉國(guó), 錢和

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

L-纈氨酸高產(chǎn)菌誘變育種的研究

張偉國(guó)1,2, 錢和3

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

以黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)L-纈氨酸產(chǎn)生菌XQ-2為出發(fā)菌株,經(jīng)硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(N TG)逐級(jí)誘變處理,氨基酸結(jié)構(gòu)類似物α-氨基丁酸(α-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)和α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)定向篩選,獲得一株L-纈氨酸高產(chǎn)菌 XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrA HVhr)。在以135 g/L葡萄糖為碳源和50 g/L硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵72 h,產(chǎn)酸達(dá)64～66 g/L。

L-纈氨酸;誘變育種;黃色短桿菌

L-纈氨酸是人體8種必需氨基酸之一,同時(shí)又是3種支鏈氨基酸之一,因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能在人類生命代謝中占有特別重要的地位,可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等方面,但由于其生產(chǎn)成本較高,價(jià)格較貴,目前主要用于配制復(fù)合氨基酸制劑,特別是應(yīng)用于高支鏈氨基酸輸液(如3H輸液等)和口服液(肝安干糖漿等)。最近,人們發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸是合成一種治療高血壓的特效藥——纈沙坦的重要中間體,其年消耗量猛增到數(shù)千噸。

目前,國(guó)際上生產(chǎn)L-纈氨酸均采用發(fā)酵法。日本的松琦氏選育的厭氣桿菌在100 g/L的葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)酸達(dá)15 g/L[1];Tsuchicla等選育的乳糖發(fā)酵短桿菌搖瓶產(chǎn)酸達(dá)31g/L[2];日本協(xié)和公司的L-纈氨酸產(chǎn)酸水平達(dá)40～50 g/L[3]。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所于1975年在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了L-纈氨酸產(chǎn)生菌北京棒桿菌突變株AS1.586的選育,產(chǎn)酸為26 g/L[4]?！捌呶濉逼陂g中國(guó)科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行了第二代纈氨酸高產(chǎn)菌的選育,搖瓶產(chǎn)酸提高到30g/L[5]。張偉國(guó)選育的黃色短桿菌XQ-2搖瓶產(chǎn)酸達(dá)42～45g/L[6];浦軍平等選育L-纈氨酸產(chǎn)生菌種搖瓶產(chǎn)酸達(dá)45g/L[7]。張偉國(guó)等選育的黃色短桿菌XQ-6搖瓶產(chǎn)酸達(dá)58～62g/L[8]。趙麗麗等選育的纈氨酸高產(chǎn)菌TV2564,5 L罐補(bǔ)料分批發(fā)酵,產(chǎn)酸達(dá)50 g/L[9]。徐慶陽等選育的L-纈氨酸高產(chǎn)菌,10 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵72 h,產(chǎn)酸可達(dá)53.4 g/L[10]。本試驗(yàn)對(duì)以前選育的L-纈氨酸產(chǎn)生菌 XQ-6定向育種,產(chǎn)酸進(jìn)一步提高,搖瓶產(chǎn)酸64～66 g/L,50 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵68 h產(chǎn)酸高達(dá)68.7 g/L。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發(fā)菌株為L(zhǎng)-纈氨酸產(chǎn)生菌XQ-2(Leul(-ABrAHVr2-TAr)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 完全培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨 10、NaCl 5、瓊脂條 25。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20、(NH4)2SO41.5、KH2PO41、K2HPO43、M gSO4·7H2O 0.5、M nSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、VH 30μg/L、VB1·HCl 100μg/L、尿素 1.5、瓊脂粉20。

1.2.3 種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 25、(N H4)2SO45、KH2PO41、M gSO4·7H2O 0.5、玉米漿 35～40、尿素 2.5、CaCO310。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖 120～150、(NH4)2SO435～50、KH2PO41、M gSO4·7H2O 0.5、M nSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、VH 25～100μg/L、VB1·HCl 50μg/L、玉米漿5～10、CaCO340。

完全、基礎(chǔ)和種子培養(yǎng)基均以20 g/dL NaOH調(diào)p H至7.5～7.6,0.1 M Pa壓力下滅菌20 m in。發(fā)酵培養(yǎng)基以20 g/dL NaOH調(diào)p H值為7.5～7.6,0.07 M Pa壓力下滅菌8 min。

1.3 主要試劑

硫酸二乙酯(DES)為上海試劑廠產(chǎn)品;亞硝基胍(N TG)為瑞士 Fluka公司產(chǎn)品;(-氨基丁酸((-AB)、α-氨基-β-羥基戊酸 (A HV)和 2-噻唑丙氨酸(2-TA)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.4 誘變方法

常規(guī)化學(xué)誘變法[11]。

1.5 氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性株檢出方法

將氨基酸結(jié)構(gòu)類似物按一定濃度混合于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,制成平板后,涂布上述經(jīng)誘變處理過的菌體,置30℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d后長(zhǎng)出的大菌落,即是氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株。

1.6 分析方法

1.6.1 p H值測(cè)定 用酸度計(jì)測(cè)定法。

1.6.2 菌體生長(zhǎng) 吸取樣品菌液0.2 m L加到5 m L濃度為0.25 mol/L HCl溶液中,搖勻后測(cè)定A562nm值。

1.6.3 葡萄糖 采用SBA-4多功能谷氨酸-葡萄糖分析儀測(cè)定。

1.6.4 L-纈氨酸 紙上層析法、比色定量法[12]和氨基酸分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-纈氨酸高產(chǎn)菌 XQ-6的選育譜系

2.1.1 α-ABhr變異株的獲得 從 XQ-2出發(fā),經(jīng)DES誘變,高濃度α-AB平板篩選,獲得α-ABhr變異株215株,經(jīng)搖瓶篩選獲得一株L-纈氨酸高產(chǎn)菌V 5-128,產(chǎn)酸質(zhì)量濃度為45～47g/L。

2.1.2 2-TAhr變異株的獲得 在獲得 V 5-128的基礎(chǔ)上,經(jīng)N TG誘變,高濃度2-TA平板篩選,獲得2-TAhr變異株163株,其中有幾株L-纈氨酸積累有不同程度的增加,代表性株V 6-56的產(chǎn)酸達(dá)55～56 g/L。

2.1.3 A HVhr變異株的獲得 繼續(xù)由N TG誘變,高濃度A HV平板篩選,獲得AHVhr變異株98株,其中有幾株L-纈氨酸積累有不同程度的增加,代表性株V 7-87的產(chǎn)酸達(dá)60～62 g/L,經(jīng)單菌落分離發(fā)酵條件優(yōu)化,產(chǎn)酸穩(wěn)定在64～66 g/L。

2.1.4 L-纈氨酸高產(chǎn)菌XQ-8的選育譜系 從選育的L-纈氨酸產(chǎn)生XQ-2出發(fā),經(jīng)DES和N TG誘變處理,L-纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物定向選育,得到L-纈氨酸高產(chǎn)菌XQ-8,具體選育譜系見圖1。

2.2 L-纈氨酸高產(chǎn)菌 XQ-8發(fā)酵條件的研究

圖1 L-纈氨酸高產(chǎn)菌XQ-8的選育譜系Fig.1 Schematic chart of mutagensis procedure for L-valine producer XQ-08 Superscript l-leaky mutant r-resistance hr-high resistance

2.2.1 各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)產(chǎn)酸的影響 考察了生物素對(duì)XQ-8菌株L-纈氨酸發(fā)酵的影響。結(jié)果表明,生物素為XQ-8菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的唯一必需因子,缺之,菌體不能生長(zhǎng)和產(chǎn)酸 (見圖2)。當(dāng)生物素添加質(zhì)量濃度為40～50μg/L時(shí),可獲得較高的L-纈氨酸積累。由于只添加純生物素時(shí)前期菌體生長(zhǎng)較慢,故進(jìn)行添加生物素同時(shí)添加少量玉米漿發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果表明,當(dāng)添加40～50μg/L生物素和0.5 g/dL玉米漿時(shí),L-纈氨酸積累最高,達(dá)64～66 g/L(見圖 3)。

圖2 生物素對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of biotin on L-valine production

圖3 添加玉米漿時(shí)生物素對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of the additional corn steep liquor and biotin on L-valine production at one time

添加支鏈氨基酸(L-亮氨酸和L-異亮氨酸),當(dāng)濃度較低(≤2 g/L)時(shí),對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響不大(如圖4所示);只有當(dāng)支鏈氨基酸的濃度較高(≥6 g/L)時(shí),則影響較大(如圖5所示)。

圖4 L-亮氨酸對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of L-leucine on L-valine production

圖5 L-異亮氨酸對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of L-isoleucine on L-valine production

2.2.2 XQ-8菌株L-纈氨酸最佳發(fā)酵條件 應(yīng)用正交試驗(yàn)法綜合考察了培養(yǎng)基成分、種齡、接種量等多種因素對(duì)菌株產(chǎn)酸的影響,得到的最佳發(fā)酵條件列于表1。

表1 L-纈氨酸搖瓶發(fā)酵的最佳條件Tab.1 Optimal fermentation condition for L-valine production

2.2.3 XQ-8菌株L-纈氨酸發(fā)酵進(jìn)程曲線 圖6為-纈氨酸高產(chǎn)菌XQ-8的典型發(fā)酵過程曲線。圖6中,0～12 h為菌體生長(zhǎng)延滯期,此時(shí)菌體耗糖速率較慢,主要用于長(zhǎng)菌,基本不產(chǎn)酸;13～36 h為菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,此時(shí)生長(zhǎng)速率達(dá)到并保持最大,耗糖速率明顯加快,并開始產(chǎn)酸;37～64 h進(jìn)入菌體穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)期,此間耗糖速率較快,L-纈氨酸大量合成;65～72 h為衰亡期,此間耗糖速率減慢,直到發(fā)酵結(jié)束。

圖6 L-纈氨酸發(fā)酵過程曲線Fig.6 Time-course of L-valine production

3 結(jié) 語

L-纈氨酸與L-亮氨酸和L-異亮氨酸的生物合成途徑是相關(guān)的,這3種氨基酸的生物合成,存在著共同的酶,因此代謝調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜。在合成途徑中存在:(1)纈氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)有抑制作用;(2)纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)有多價(jià)阻遏作用。

L-纈氨酸生物合成的限速酶為α-乙酰羥基酸合成酶(AS)。因此,如果要在培養(yǎng)基中積累大量L-纈氨酸,就必須解除正常的反饋調(diào)節(jié),即解除L-纈氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的反饋抑制及L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的多價(jià)阻遏。α-AB為L(zhǎng)-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,其高濃度抗性突變株可解除了L-纈氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的反饋抑制;2-TA為L(zhǎng)-纈氨酸和L-亮氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,其高濃度抗性突變株也同樣可解除了L-纈氨酸和L-亮氨酸對(duì)α-乙酰羥基酸合成酶(AS)的多價(jià)阻遏,使得AS的酶活極大幅度地提高,其結(jié)果在培養(yǎng)基中積累大量L-纈氨酸;AHV為蘇氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,其抗性突變株為何能提高L-纈氨酸的積累?其機(jī)制尚沒有解明,是否存在A HV抗性可解除異亮氨酸對(duì)AS的多價(jià)反饋調(diào)節(jié),這一點(diǎn)值得進(jìn)一步探討。

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Studies on the Breeding of L-Valine Hyper-Producing M utan t

ZHANGWei-guo1,2, Q IAN He3
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;3.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

U singB revibacterium flavumXQ-2(Leul(-ABrA HVr2-TAr)as a starting strain for stepwise mutagenesis by diethylsulfate (DES),N-methyl-N’-nitro-soguanidine (N TG)treatment,a L-valine hyper-producing mutant XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrAHVhr)was obtained,w hich could be resistant to high concentrationα-amino-butyric acid(α-AB),2-thiazole-DL-alanaine(2-TA)andα-amino-β-hydroxy-valeric acid(AHV).A s a result,high L-valine concentration(64～66g/L)was obtained with shaking at 31±1℃for 72h in the medium containing 135g/L glucose and 50g/L(NH4)2SO4.

L-valine,breeding,brevibacterium flavum

TQ 922

A

1673-1689(2011)03-0394-04

2010-05-25

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA 02Z212)。

張偉國(guó) (1963-),男,江蘇張家港人,工學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事氨基酸生產(chǎn)菌選育和發(fā)酵工藝控制研究。Email:zhangw g168@126.com