丁振柱, 黃仁華, 王 丹

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

費(fèi)約果葉片總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

丁振柱, 黃仁華＊, 王 丹

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

對(duì)費(fèi)約果葉片總黃酮的提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:費(fèi)約果葉片總黃酮最佳提取工藝為溫度50℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取時(shí)間50 min和甲醇體積分?jǐn)?shù)70%。根據(jù)最佳提取工藝,重復(fù)3次得到總黃酮量分別46.89、44.51、48.27 mg/g,具有穩(wěn)定性和可操作性;另外,通過(guò)半抑制濃度IC50衡量費(fèi)約果葉片總黃酮提取物抗氧化活性,其抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力(IC500.275 mg/m L)和DPPH·自由基的清除能力(IC500.798 m g/m L)均優(yōu)于抗壞血酸(IC500.643、IC500.917 mg/m L),而超氧陰離子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和羥自由基的清除能力(IC500.278 m g/m L)均弱于抗壞血酸(IC500.537、IC500.275 mg/m L)。

費(fèi)約果;總黃酮;提取;抗氧化

費(fèi)約果(Feijoa sellowianaBerg)系桃金娘科多年生亞熱帶常綠灌木果樹(shù),原產(chǎn)于南美洲的巴西和烏拉圭,2004年由西南科技大學(xué)從新西蘭引種至我國(guó)四川綿陽(yáng)地區(qū)[1],經(jīng)過(guò)近幾年馴化引種研究,已逐步進(jìn)入推廣種植階段。費(fèi)約果葉片中含有大量的生物活性物質(zhì),包括維生素、黃酮、豆甾醇、β-胡蘿卜素、對(duì)羥基苯乙醇等等,是一種理想的綠色藥用資源[2]。本研究以費(fèi)約果葉片為原料,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化總黃酮提取工藝并分析提取物濃度與抗脂質(zhì)過(guò)氧化、DPPH·、O2-·、·OH等自由基清除率的關(guān)系,為進(jìn)一步推廣費(fèi)約果的種植和發(fā)掘天然抗氧化活性成分以及提高費(fèi)約果的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用費(fèi)約果葉片于2009年3月中旬采自西南科技大學(xué)西山校區(qū)費(fèi)約果栽培園中。三吡啶三吖嗪(Tripyridyl triazine,TPTZ)、1,1-二苯基苦基苯阱(DPPH)及蘆丁購(gòu)自 Sigma公司,其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì) UV-1900:日本島津產(chǎn)品;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):美國(guó)Beckman產(chǎn)品;KQ5200B型超聲波清洗機(jī):旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);恒溫水浴鍋:上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn);循環(huán)水式多用真空泵 SHB-ⅢS:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 費(fèi)約果葉片總黃酮提取工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn) 影響植物組織類(lèi)黃酮提取的因素很多,根據(jù)前人研究結(jié)果結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未列出),結(jié)果發(fā)現(xiàn)最主要的因素包括提取溫度、料液比、提取時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù),而且各因素之間存在著交互作用,據(jù)以此本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),以費(fèi)約果葉片提取物中總黃酮的含量確定最佳提取工藝,試驗(yàn)設(shè)計(jì)的影響因素及水平條件見(jiàn)表1所示。

1.3.2 費(fèi)約果葉片總黃酮提取 根據(jù) Kim的方法結(jié)合超聲波提取葉片中的總黃酮[3]。準(zhǔn)確稱(chēng)取新鮮費(fèi)約果葉片1.0 g用于總黃酮的提取,將新鮮的樣品表面水分晾干后放在冰浴上研磨,直至研磨到?jīng)]有肉眼可見(jiàn)的塊狀葉片后將勻漿轉(zhuǎn)入離心管中,按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行超聲波提取,提取后4℃條件下4 000 r/m in離心10 m in收取上清液,轉(zhuǎn)移至50 m L蒸發(fā)瓶中,在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取液中的甲醇,直至蒸干。用4 m L重蒸去離子水溶解殘留物并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,4℃條件下10 000 r/min離心10 m in,上清液貯存于-20℃冰箱中備用。

表1 費(fèi)約果葉片總黃酮提取正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experiment design for extracting flavonoids from Feijoa leaves

1.3.3 費(fèi)約果葉片總黃酮含量測(cè)定 根據(jù) Kim等方法測(cè)定總黃酮含量[3-4],取提取液0.1 mL放入10 m L試管中,接著加入1.9 m L重蒸去離子水混合均勻后,立即往試管中加入0.15 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaNO2充分震蕩,5 min后加入0.15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%A lCl3反應(yīng)1 m in后,加入1 m L 1 mol/L NaOH混合均勻,室溫放置反應(yīng)3～5 min,當(dāng)反應(yīng)液顏色變至粉紅色,在510 nm條件下用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。用蘆丁(Rutin)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),葉片總黃酮含量用等量蘆丁表示。

1.3.4 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定 分別于樣品管中依次加入1 m L卵磷脂溶液(將300 mg卵磷脂溶于30 m L 10mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液的溶液中,冰浴振蕩)、1 m L 0.4 mmol/L硫酸亞鐵、1 m L樣品,混勻。避光于37℃水浴60 min,加入2 m L三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-HCl混合液(15 g TCA,0.37 g TBA,2.1 m L濃鹽酸依次放入100 m L水中),90～100℃水浴15 m in,迅速冷卻,以3 000 r/min離心10 min,取上清液在535nm測(cè)吸光度A1。空白管以1 m L重蒸水代替1 m L樣品,操作方法同樣品管,可測(cè)得空白管的吸光度A2,參比管中以1 m L重蒸水代替1 m L卵磷脂。根據(jù)其線(xiàn)性回歸方程求出吸光度為0.5時(shí)所需樣品的有效濃度(IC50),抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照[5]。

抑制率(%)=[(A2-A1)/A2]×100

1.3.5 對(duì)DPPH·自由基清除率的測(cè)定 準(zhǔn)確移取不同濃度費(fèi)約果葉片總黃酮提取液2 m L于10 m L試管中,加入 2 m L DPPH·溶液 (8 mg DPPH·用體積分?jǐn)?shù)80%無(wú)水乙醇溶解并定容于100 m L棕色容量瓶),充分混勻,室溫靜置,30 m in后用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定其吸光度A1(以體積分?jǐn)?shù)80%無(wú)水乙醇溶液為參比);同時(shí)測(cè)定2 mL DPPH·溶液與2 mL體積分?jǐn)?shù)80%無(wú)水乙醇溶液混合液的吸光度A2,以及不同濃度2 m L提取液與2m L 80%無(wú)水乙醇溶液混合液的吸光度A3。平行測(cè)定3次,取平均值后根據(jù)以下公式計(jì)算清除率。根據(jù)其線(xiàn)性回歸方程求出吸光度為0.5時(shí)所需樣品的有效濃度(IC50),抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照[6]。

清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%

1.3.6 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 先將50 mmol/L Tris-HC1緩沖液(PH 8.2),3 mmol/L鄰苯三酚溶液(用10 mmol/LHC1配制),置25℃水浴預(yù)熱15 min。然后取 Tris-HC1緩沖液4.0 m L于試管中,加入不同濃度供試液 1.7 m L,3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL,以加入鄰苯三酚的瞬間開(kāi)始計(jì)時(shí),以水為空白,測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始第100秒時(shí),325 nm波長(zhǎng)處吸光度A1。對(duì)照組A2使用無(wú)水乙醇代替供試液,對(duì)照組(A3)使用10 mmol/L HC1溶液代替鄰苯三酚溶液。每個(gè)濃度梯度平行測(cè)定3次,求平均值。并根據(jù)其線(xiàn)性回歸方程求出吸光度為0.5時(shí)所需樣品的有效濃度(IC50)。同時(shí),以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照[7]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

1.3.7 對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定取1 m L 9 mmol/L硫酸亞鐵與1 mL 10 mmol/L水楊酸于10 m L試管充分混合后,分別加入不同濃度費(fèi)約果葉片總黃酮提取液1 mL,加1 m L過(guò)氧化氫(8.8 mmol/L)啟動(dòng)反應(yīng),37℃反應(yīng)30 min,以蒸餾水作參比,在510 nm下測(cè)吸光度A1。對(duì)照組A2用無(wú)水乙醇代替供試液。對(duì)照組A3用純凈水代替過(guò)氧化氫(8.8 mmol/L)。每個(gè)濃度梯度平行測(cè)定3次,求平均值。并根據(jù)其線(xiàn)性回歸方程求出吸光度為0.5時(shí)所需樣品的有效濃度(IC50),以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照[8]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 費(fèi)約果葉片總黃酮提取正交試驗(yàn)

以提取溫度、料液比、提取時(shí)間、甲醇濃度為因素的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所示,每個(gè)處理提取3次。從表中極差分析可以看出,提取溫度顯著影響著費(fèi)約果葉片總黃酮的提取效果,表現(xiàn)最為明顯,其次為料液比,影響最小的因素為甲醇濃度,即各因素對(duì)費(fèi)約果葉片總黃酮提取效果的主次順序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時(shí)間>甲醇體積分?jǐn)?shù),進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)提取工藝的最優(yōu)方案為A1B1C2D2,即提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取時(shí)間50 min和甲醇體積分?jǐn)?shù)70%為最佳提取工藝組合。根據(jù)最佳提取工藝組合進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),得到的費(fèi)約果葉片總黃酮提取物量分別為:46.89mg/g、44.51mg/g、48.27 mg/g,均要高于正交表中所有試驗(yàn)結(jié)果,且具有較好的重現(xiàn)性和可操作性。

表2 費(fèi)約果葉片總黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal experiment for extracting total flavonoids from Feijoa leaves

2.2 費(fèi)約果葉片總黃酮提取物抗氧化活性

費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì) Fe2+引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)體過(guò)氧化的抑制作用見(jiàn)圖3(a)所示,當(dāng)總黃酮提取物質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),抑制率為43%,質(zhì)量濃度為0.4 mg/m L時(shí)抑制率為69%,再增加提取物質(zhì)量濃度,抑制率增長(zhǎng)緩慢。用半抑制濃度IC50衡量,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力(IC500.275 mg/m L)要顯著優(yōu)于抗壞血酸(IC500.643 mg/mL)。

圖3(b)反映了費(fèi)約果葉片總黃酮提取物清除DPPH·能力與濃度的變化關(guān)系,從圖中可以看出,隨著提取產(chǎn)物總黃酮質(zhì)量濃度的增加,DPPH·的清除率也隨之增加,且在低濃度范圍內(nèi)(0.5～1.0 mg/mL)增長(zhǎng)較快。另外,質(zhì)量濃度為0.5 mg/m L時(shí),費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除率與抗壞血酸相當(dāng),而較高質(zhì)量濃度下費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除率高于抗壞血酸。用半抑制濃度IC50衡量,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除能力(IC500.798 mg/m L)要優(yōu)于抗壞血酸(IC500.917 mg/m L)。

圖1 費(fèi)約果葉片總黃酮不同濃度提取物抗脂質(zhì)能力(a)、清除DPPH·能力(b)、清除O2-·(c)和清除·OH(d)能力Fig.1 Capability of total flavonoids with various concentrations from Feijao leaves on inhibiting lipid peroxidation,scavenging DPPH.,O2-·and ·OH

從圖3(c)和圖3(d)中可以看出,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子(O2-·和羥自由基(·OH)的清除率均隨著濃度的增加而增強(qiáng)。但在相同濃度條件下,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)超氧自由基和羥自由基清除率均顯著低于抗壞血酸。用半抑制濃度IC50衡量,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和對(duì)羥自由基的清除率(IC500.278 mg/m L)均要弱于抗壞血酸(IC500.537 mg/m L)和(IC500.064 m g/m L)。

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)費(fèi)約果葉片總黃酮提取工藝的單因素試驗(yàn)(預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果未列出)和正交試驗(yàn)分析,確定了費(fèi)約果葉片總黃酮提取的最佳工藝為提取溫度50℃、料液比1∶30(g∶m L)、提取時(shí)間50 m in和甲醇體積分?jǐn)?shù)70%。

抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化具有較強(qiáng)的抑制效果,且顯著高于抗壞血酸,其原因可能是費(fèi)約果葉片中黃酮提取成分中具有能螯合鐵離子的有效物質(zhì),表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化[9];另一方面,費(fèi)約果葉片總黃酮提取物在清除O2-·、·OH等離子方面要弱于抗壞血酸,可能與黃酮有效成分的結(jié)構(gòu)有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of the Total Flavonoids from Feijoa sellowiana Leaves

DING Zhen-zhu, HUANG Ren-hua＊, WANG Dan

(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621002,China)

This manuscript optimized the extraction technologies and investigated the antioxidant activities of the total flavonoids fromFeijoa sellowianaleaves.The results determined that the optimum parameters of extraction process as follow s:the extraction temperature 40℃,the ratio of sample to extraction solution 1:30,the extraction time 50 min and the concentration methyl alcohol 70%.With the optimum extraction parameters,the total flavonoids contents with three reiterations achieved at 46.89 mg/gFW,44.51 mg/gFW and 48.27mg/gFW,respectively.In addition,half-inhibitory concentration IC50 was used to evaluate antioxidant activities of total flavonoids from Feijoa leaves.The capability of inhibiting lipid peroxidation(IC500.275 mg/mL)and scavenging effects on DPPH freedom radical(IC500.798 mg/m L)of to talflavonoids extracts were stronger than the co rresponding values of ascorbic acid(IC500.643 mg/m L and IC500.917 mg/m L).However,the scavenging effects on superoxide anion(IC500.774 mg/m L)and hydroxyl freedom radical(IC500.278 mg/mL)were weaker than that of ascorbic acid(IC500.537 mg/m L and IC500.275 mg/m L).

book=372,ebook=501

Feijoa sellowiana,total flavonoids,extraction technology,antioxidant activities

TS 201.2

A

1673-1689(2011)03-0371-05

2010-05-20

四川省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(07zs2106);西南科技大學(xué)博士基金項(xiàng)目(08zx7104)。

＊

黃仁華(1979-),男,湖北鐘祥人,農(nóng)學(xué)博士,副教授,主要從事植物化學(xué)成分結(jié)構(gòu)與功能開(kāi)發(fā)方面的研究。Email:huangrenhua@sw ust.edu.cn

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