魏鵬飛, 馮杰, 王棟, 鄭志永, 詹曉北＊, 張麗敏

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

響應(yīng)面法優(yōu)化醬油生產(chǎn)用大曲培養(yǎng)基

魏鵬飛1,2, 馮杰1,2, 王棟1,2, 鄭志永1,2, 詹曉北＊1,2, 張麗敏1,2

(1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

在工廠大曲培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)影響大曲蛋白酶活的關(guān)鍵影響因子進(jìn)行了研究和探討。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了大曲蛋白酶活和培養(yǎng)基組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,并求解得到了大曲培養(yǎng)基組成的最佳配比,即豆粕∶炒麥∶拌料水的比例為11.3∶10.5∶19.6(g∶g∶m L)。在此最佳配比下大曲蛋白酶活達(dá)到2 402U/g,比對(duì)照配方的酶活提高了20%。

醬油生產(chǎn);大曲;蛋白酶;響應(yīng)面法;優(yōu)化

制曲是中國(guó)傳統(tǒng)技術(shù),諺語(yǔ)有一曲、二醪、三熬油的說(shuō)法,說(shuō)明了制曲的重要性。目前醬油釀造主要選用純種米曲霉,以適宜的條件保證米曲霉等有益微生物生長(zhǎng)繁殖,使米曲霉分泌產(chǎn)生所需要的各種酶系,達(dá)到大曲優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的[1]。

蛋白酶作為米曲霉分泌的酶系中能夠提高原料蛋白利用率,提高發(fā)酵醬油氨基態(tài)氮含量的關(guān)鍵酶,其在大曲制作過(guò)程中的產(chǎn)量對(duì)醬油品質(zhì)的好壞和生產(chǎn)成本的高低有著直接的影響,而且提高蛋白酶活還可以減少釀造工業(yè)的污染[2-3]。在實(shí)際的醬油生產(chǎn)過(guò)程中,多方面因素影響著制曲過(guò)程中成曲蛋白酶活的高低。國(guó)外有文獻(xiàn)提到培養(yǎng)基的成分和水活度是兩個(gè)比較重要的影響固態(tài)發(fā)酵中真菌產(chǎn)酶的因素[4]。工廠中主要采用蒸熟后豆粕與炒麥混料模式制作大曲培養(yǎng)基[5],可以看出大曲培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶有著比較重要的影響。因此,有必要對(duì)大曲培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。

目前,統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法有很多,響應(yīng)面分析法是一種非常適用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、因子效應(yīng)評(píng)估、尋求因子水平最佳操作條件以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理等功能,顯示出了其他實(shí)驗(yàn)方法如正交實(shí)驗(yàn)、因子實(shí)驗(yàn)等所不具備的優(yōu)點(diǎn)[6-9]。響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)有著實(shí)驗(yàn)次數(shù)少,精度高,預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)經(jīng)常被用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、最佳反應(yīng)條件尋優(yōu)等方面[10-13]。

針對(duì)醬油生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)工藝,選擇豆粕、炒麥和拌料水為考察變量,在工廠生產(chǎn)大曲經(jīng)驗(yàn)配方的基礎(chǔ)上,應(yīng)用中心組合設(shè)計(jì),以大曲的蛋白酶活作為響應(yīng)值,并采用多元二次回歸和方差分析等手段,對(duì)大曲培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 米曲霉(Aspergillus oryzaeCICIM F0899),由作者所在的江南大學(xué)生化工程與反應(yīng)器研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1)菌種活化培養(yǎng)基:馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基[2]。

2)小曲培養(yǎng)基[2]:按照麩皮∶豆粕質(zhì)量比為4∶1的比例在250mL三角瓶中加入20 g過(guò)10目篩的干料,12 g蒸餾水,拌勻。121℃,0.1M Pa滅菌30 m in。

1.1.3 原料 食用大豆粕:河北秦皇島益海豆粕有限公司生產(chǎn),符合中華人民共和國(guó)食用大豆粕衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 14932.1-2003)[14];冬小麥:無(wú)錫三里橋糧油市場(chǎng)購(gòu)買。

1.2 方法

1.2.1 制曲方法 將豆粕、炒麥和拌料水按照設(shè)計(jì)配比混勻后,經(jīng)過(guò)121℃,30 min滅菌處理。按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%接種量接入培養(yǎng)好的種曲,控制曲料品溫在30℃培養(yǎng)48 h,取樣測(cè)定大曲蛋白酶酶活。

1.2.2 小麥焙炒粉碎 小麥在320℃條件下焙炒1～3 min,其中焦糊粒不超過(guò)5～20%,小麥裂嘴為90%以上,熟麥投水實(shí)驗(yàn)時(shí),沉降率為3～5%[15]。

1.2.3 取樣時(shí)間確定 以中心點(diǎn)初始配方,即工廠大曲培養(yǎng)基制曲,分段取樣測(cè)定大曲的蛋白酶活,從而得到大曲蛋白酶活隨時(shí)間的變化曲線,以確定測(cè)定大曲酶活的最佳時(shí)間。

1.2.4 蛋白酶提取方法 向取出的大曲曲樣中加入1∶20(g∶m L)的 0.1mol/L,p H值為 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液,于40 ℃水浴中,間歇攪拌,浸提1h,濾紙過(guò)濾得蛋白酶酶液。

1.2.5 蛋白酶活測(cè)定方法 采用福林酚法。參照中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測(cè)定法(SB/T 10317-1999)[16]。大曲蛋白酶活定義為1g干重大曲中所含的蛋白酶在40℃,p H值為7.2條件下每1 min水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 分析優(yōu)化方法 大曲培養(yǎng)基組成按照響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。中心組合設(shè)計(jì)由Box和Wilson提出,是響應(yīng)曲面中最常用的二階設(shè)計(jì),它由3部分組成:立方體點(diǎn)、中心點(diǎn)和星點(diǎn)[17]。對(duì)于本實(shí)驗(yàn),選擇大曲配方中的豆粕、炒麥和拌料水3個(gè)因素,并以工廠的經(jīng)驗(yàn)配方為初始水平,考察制曲過(guò)程中蛋白酶活的變化,對(duì)大曲培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化,中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)選擇6次。此設(shè)計(jì)由全23因子設(shè)計(jì)構(gòu)成的8個(gè)點(diǎn),6個(gè)中心點(diǎn)的重復(fù)以及6個(gè)星臂點(diǎn),即每個(gè)因素軸上距中心點(diǎn)±α處各一個(gè)點(diǎn)組成。軸距離α選擇為1.682使得該設(shè)計(jì)為正交設(shè)計(jì)[10]。為了預(yù)測(cè)最佳點(diǎn),用二次多項(xiàng)式擬合中心組合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。該多項(xiàng)式方程為:

式中,Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值,即大曲的蛋白酶活;X1、X2和X3分別為豆粕、炒麥和拌料水。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)利用Design-Expert7.1.3(Stat-Ease,Inc.)軟件對(duì)處理,用F(Fischer)檢驗(yàn)評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型方程的顯著性,方程的擬合性由確定系數(shù)R2確定,以確立大曲培養(yǎng)基中豆粕、炒麥和拌料水的最佳配比。

2 結(jié)果與討論

2.1 大曲的生長(zhǎng)產(chǎn)酶曲線

以中心點(diǎn)初始配方,即工廠大曲培養(yǎng)基制曲,分別在 0、12、24、36、48和 72 h取樣測(cè)定大曲的蛋白酶活,從而得到了大曲蛋白酶活隨時(shí)間的變化曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可知,大曲的蛋白酶的產(chǎn)生主要集中在12～36 h,蛋白酶活在48 h時(shí)達(dá)到最大,并隨著制曲時(shí)間的增長(zhǎng)蛋白酶活會(huì)逐漸下降。因此選擇48 h作為取樣測(cè)定大曲蛋白酶活的最佳時(shí)間點(diǎn)。

圖1 醬油大曲的產(chǎn)蛋白酶過(guò)程曲線Fig.1 Protease production of Aspergillus oryzae in koji

2.2 中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化大曲培養(yǎng)基組成

對(duì)影響大曲生產(chǎn)中蛋白酶酶活的培養(yǎng)基組成中的豆粕、炒麥和拌料水進(jìn)行了三因素五水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1和表2。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels for response surface analysis

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Response surface central composite design and corresponding experiment results

由此實(shí)驗(yàn)的實(shí)際值用二次多項(xiàng)式進(jìn)行回歸,其結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析Tab.3 Regression analysis of the experiment results

由表3中的回歸系數(shù)可以寫出二次多項(xiàng)式回歸方程為:

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,方差分析結(jié)果見表4。

表4 二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Tab.4 Analysis of variance for quadratic polynomial model

由表4的方差分析看出,該模型的舉動(dòng)決定系數(shù)R2=0.927 9,顯著性水平α=0.000 1。R2值0.972 9說(shuō)明了97.29%的響應(yīng)值變化是由該模型決定的。R值為0.963 3說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中蛋白酶活的實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值有96.33%的一致性。由此表明,該模型可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。

此外,由表4中的方差分析可以看出,因素X1、X2即豆粕和炒麥的交互影響顯著性水平α=0.886 6,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05(置信水平95%),說(shuō)明豆粕和炒麥的交互影響對(duì)大曲蛋白酶活的影響不夠顯著。由方差分析還可以看出拌料水在大曲培養(yǎng)基中所占的比例對(duì)大曲最終蛋白酶活的影響非常顯著。大曲培養(yǎng)基組成中的豆粕、炒麥和拌料水與大曲蛋白酶活的關(guān)系分別見圖2、圖3和圖4。響應(yīng)面可以直接反映出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小。分析圖2、圖3和圖4可以看出分析結(jié)果和方差分析的結(jié)果相一致。

2.3 模型驗(yàn)證

對(duì)擬合出的二次多項(xiàng)式回歸方程分別求X1、X2和X3的偏導(dǎo)數(shù),求得各個(gè)因素的極值點(diǎn):

即大曲培養(yǎng)基組成的配比為豆粕∶炒麥∶拌料水=11.3∶10.5∶19.6時(shí)產(chǎn)蛋白酶活最高。以上述分析得到的最佳培養(yǎng)基組組成制曲,做三次平行實(shí)驗(yàn)取蛋白酶活的平均值驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果見表5。

圖2 豆粕和炒麥配料比對(duì)蛋白酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plot of protease activity at various weights of soy bean and fried wheat

圖3 豆粕和拌料水配料比對(duì)蛋白酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Contour plot of protease activity at various weights of soy bean and water

圖4 炒麥和拌料水配料比對(duì)蛋白酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plot of protease activity at various weights of fried and water

表5 最優(yōu)條件下蛋白酶活的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值比較Tab.5 Performance comparison of protease activity between the model simulation and experiment results at optimum conditions

可知,蛋白酶活的預(yù)測(cè)值為2 455 U/g,實(shí)驗(yàn)實(shí)際值為2 402 U/g,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2%,在模型允許的誤差范圍之內(nèi)。說(shuō)明模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際制曲情況,響應(yīng)面分析方法可靠。

3 結(jié) 語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)選擇大曲配方中的豆粕、炒麥和拌料水3個(gè)因素,在工廠經(jīng)驗(yàn)配方的初始水平上,應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)大曲培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。借助Design Expert軟件,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了大曲蛋白酶活和大曲培養(yǎng)基組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,并通過(guò)分析模型方程和響應(yīng)面3D圖得到了大曲培養(yǎng)基組成的最佳配比,即豆粕:炒麥:拌料水的比例為11.3∶10.5∶19.6。通過(guò)對(duì)大曲培養(yǎng)基的優(yōu)化,酶活比未經(jīng)優(yōu)化的經(jīng)驗(yàn)配方提高了20%。通過(guò)對(duì)模型的方差分析和響應(yīng)面3D圖分析,可以看出在大曲生產(chǎn)過(guò)程中,豆粕和炒麥的比例對(duì)大曲產(chǎn)蛋白酶活的影響較小,而拌料水在大曲中所占的比例對(duì)蛋白酶活有著很重要的影響,這對(duì)醬油釀造工廠大曲生產(chǎn)有著一定的指導(dǎo)意義。

（References）：

[1]林祖申.米曲霉制曲過(guò)程中酶活性變化及其工藝優(yōu)化[J].中國(guó)釀造,2007,5:56-59.

L IN Zu-shen.Change of enzyme activity inAspergillus oryzaecultivation and technical optimization[J].China Brewing,2007,5:56-59.(in Chinese)

[2]鄧靜,吳華昌,吳明霞等.米曲霉產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造,2008,12:51-53.

DENG Jing,WU Hua-chang,WU Ming-xia,et al.Condition optimization for the production of protease byAspergillus oryzae[J].China Brewing,2008,12:51-53.(in Chinese)

[3]賈愛娟.提高高鹽稀態(tài)法釀造醬油原料蛋白質(zhì)利用率及氨基酸出品率的研究[D].陜西:西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

[4]Krishna C.Solid-state fermentation system s-an overview[J].Critical Reviews in Biotechnology,2005,25:1-30.(in Chinese)

[5]魯肇元,魏克強(qiáng).“釀造醬油”高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝綜述[J].中國(guó)調(diào)味品,2006,1:28-31.

LU Zhao-yuan,WEI Ke-qiang.Discuss on the high salt liquid state fermentation of the soy sauce[J].China Condiment,2006,1:28-31.(in Chinese)

[6]Phiarais B P N,Schehl B D,Oliveira J C,et al.Use of response surface methodology to investigate the effectiveness of commercial enzymes on buck wheat malt for brewing purposes[J].Journal of the Institute of Brewing,2006,112:324-332.

[7]Elibol M.Optimization of medium composition for actinorhodin production by Strep tomyces coelicolor A 3(2)with response surface methodology[J].Process Biochemistry,2004,39:1057-1062.

[8]李蕾,岳喜華,于歡等.響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿果多糖的提取工藝[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(1):53-56.

L ILei,YUE Xi-hua,YU Huan,et al.Optimization of the extraction of polysaccharide(PAP)by response surface analysis[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2009,28(1):53-56.(in Chinese)

[9]劉代新,寧喜斌,張繼倫.響應(yīng)面分析法優(yōu)化副溶血性弧菌生長(zhǎng)條件[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(2):306-310.

L IU Dai-xin,N ING Xi-bin,ZHANG Ji-lun.Optimization of growth condition of vibrio parahaemolyticus via response surface methodology[J].Microbiology,2008,35(2):306-310.(in Chinese)

[10]曾文爐,趙飛飛,曹照根等.利用響應(yīng)面方法優(yōu)化轉(zhuǎn)小鼠金屬硫蛋白-Ⅰ基因聚球藻7002的培養(yǎng)基成分[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(1):130-136.

ZENGWen-lu,ZHAO Fei-fei,CAO Zhao-gen,et al.Medium optimization by response surface method for transgenic synechococcus sp.PCC 7002 with mousemetauothionein-Ⅰgene[J].Chinese Journal of Biotechnology,2008,24(1):130-136.(in Chinese)

[11]Vohra A,Satyanarayana T.Statistical optimization of the medium components by response surface methodology to enhance phytase production by Pichia anomala[J].Process Biochemistry,2002,37(9):999-1004.

[12]王普,孫立明,何軍邀.響應(yīng)面法優(yōu)化熱帶假絲酵母104菌株產(chǎn)羰基還原酶發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(6):863-868.

WANG Pu,SUN Li-ming,HE Jun-yao.Medium optimization for enhanced production of carbonyl reductase by Candida tropicalis 104 by response surface methodology[J].Chinese Journal of Biotechnology,2009,25(6):863-868.(in Chinese)

[13]韓景華,李呂木,張邦輝等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化大豆11S球蛋白提取工藝條件[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(4):70-74.

HAN Jing-hua,L ILu-mu,ZHANG Bang-hui,et al.Optimization of extraction conditions for 11S globulin from soybean by response surface methodology[J].Food and Fermentation Industries,2009,35(4):70-74.(in Chinese)

[14]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).食用大豆粕衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].GB 14932.1-2003中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[15]張妍,范志軍.高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油生產(chǎn)工藝及危害分析[J].中國(guó)調(diào)味品,2008,4:67-70.

ZHANG Yan,FAN Zhi-jun.High salt liquid-state fermentive technology and hazard analysis in soy sauce production[J].China Condiment,2008,4:67-70.(in Chinese)

[16]上海市釀造科學(xué)研究所,中華人民共和國(guó)商業(yè)部.蛋白酶活力測(cè)定法[S].SB/T 10317-1999中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社,1999.

[17]張冬冬,陶文沂,崔鳳杰等.響應(yīng)面法優(yōu)化白首烏中抗氧化成分的提取[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,25(5):81-87.

ZHANG Dong-dong TAO Wen-yi Cui Feng-jie,et al.Optimization of the processing parameters for the extraction of antioxidants from cynanchum auriculatum royle ex wight using response surface methodology[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2006,25(5):81-87.(in Chinese)

Optimization of Koji Medium in Soy Sauce Production Using Response Surface Methodology

WEI Peng-fei1,2, FENG Jie1,2, WANGDong1,2, ZHENG Zhi-yong1,2,ZHAN Xiao-bei＊1,2, ZHANG Li-min1,2
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Based on the factory production medium formula of koji,response surface methodology was used to optimize the protease production in this manuscript.A multivariate model was proposed to manifest the interactions of the medium components.It was showed that the optimum,weight proportion of soy bean,fried wheat and water in koji medium is 11.3∶10.5∶19.6 with this optimum conditions,a high level of koji protease activity(2402 U/g)was achieved,it was higher 20%than that of the control.

soy sauce production,koji,protease,response surface methodology,optimization

Q 819

A

1673-1689(2011)03-0422-05

2010-05-21

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B00);國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BA I63B06,2007BAK36B03)。

＊

詹曉北(1962-),男,北京人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要從事生化工程與反應(yīng)器等研究。Emial:xbzhan@yahoo.com

book=426,ebook=534