袁 斌，周岐新（重慶醫(yī)科大學藥學院藥理教研室，重慶市400016）

產(chǎn)生β-內酰胺酶是革蘭陰性桿菌重要耐藥機制之一。AmpC酶與超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）作為當前最具臨床意義的β-內酰胺酶，具有極高的研究價值。有學者將細菌同時產(chǎn)生質粒型AmpC酶和ESBLs定義為超-超廣譜β-內酰胺酶（SSBLs）[1]。我們通過三維試驗檢測在川東北地區(qū)是否也存在同時產(chǎn)質粒介導AmpC酶和ESBLs的高度耐藥菌株，通過聚合酶鏈式反應（PCR）實驗確定AmpC酶與ESBLs基因型，建立一種可靠的實驗室檢測產(chǎn)SSBLs方法，指導臨床合理用藥，防止產(chǎn)SSBLs株的區(qū)域性流行。

1 實驗材料

1.1 菌株

收集自2008年1月－2009年6月從川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床分離革蘭陰性桿菌237株（非同一患者同一部位重復分離）。所有菌株均經(jīng)過法國生物梅里埃公司的Vitek 32全自動微生物鑒定儀進行鑒定。質控菌株：標準質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC 700603為ESBLs陽性對照菌，由四川抗菌素工業(yè)研究所提供；陰溝腸桿菌029M為AmpC酶陽性對照菌，E.coli C600為川北醫(yī)學院藥理教研室李萇清博士惠贈。

1.2 試劑

氨芐西林（AMP）購自中國藥品生物制品檢定所，頭孢西?。‵OX）購自海南輕騎海藥股份有限公司，頭孢曲松（CRO）購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司，氨曲南（AZ）購自重慶圣華曦藥業(yè)，阿米卡星（AMK）購自江蘇吳中實業(yè)股份有限公司，亞胺培南（IMP）購自默沙東制藥有限公司，頭孢他啶（CAZ）、頭孢哌酮（CPZ）、頭孢噻肟（CTX）和頭孢哌酮/舒巴坦（CPZ/SB）由哈藥集團制藥總廠提供，哌拉西林（PIP）購自齊魯制藥廠，頭孢吡肟（FEP）購自施貴寶制藥有限公司，左氧氟沙星（LEV）購自山西威奇達藥業(yè)有限公司，哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZ）購自珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，克拉維酸（CA）、氯唑西林（CLO）購自中國藥品生物制品檢定所；頭孢噻肟紙片（30 μg/片）購于北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司；PCR反應系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）。

1.3 儀器

Sakuma MIT-P細菌多點接種儀（日本佐久間公司）；PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 MIC實驗

采用瓊脂二倍稀釋法，判斷標準依照2008年美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗稀釋法標準作為判斷。

2.2 改良三維試驗

采用超聲破碎法制備分離菌株β-內酰胺酶粗提液；涂布大腸埃希菌ATCC 25922的M-H平板中央貼上CTX紙片，然后在距CTX紙片邊緣5 mm處用刀片作放射狀向外切4個裂隙（分別編號A、B、C、D），在4個裂隙中分別加入待測酶粗提液30 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CA溶液10 μL；酶粗提液30 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL；酶粗提液 30 μL+2 mmol·L－1CA 溶液 10 μL+2 mmol·L－1CLO 溶液 10 μL。37℃過夜培養(yǎng)。平板若在裂隙與CTX紙片交界處出現(xiàn)矢狀的細菌生長區(qū)域者判為陽性，反之則為陰性。A、C號裂隙陽性為單產(chǎn)ESBLs；A、B號裂隙陽性為單產(chǎn)AmpC酶；A、B、C號裂隙陽性為同時產(chǎn)ESBLs與AmpC酶。A、B、C、D號裂隙皆為陰性則為陰性結果。

2.3 質粒結合實驗

以E.coli C600作為受體菌，以同時產(chǎn)ESBLs與AmpC酶的陽性菌株作為供體菌，參考文獻[2]操作。

2.4 PCR法擴增耐藥基因

堿裂法提取結合試驗結合子的質粒DNA，以其為模板，參考文獻[3，4]，擴增編碼ESBLs的基因SHV、TEM、CTX-M、OXA；擴增編碼 AmpC 酶的基因 MOX、CIT、DHA、ACC、FOX、ACT。所有PCR擴增產(chǎn)物送上海英駿生物技術有限公司測序。

3 結果

3.1 MIC測定結果

臨床分離革蘭陰性桿菌對抗生素耐藥率詳見表1。

由表1可見，臨床分離革蘭陰性桿菌對多種抗生素存在著較高的耐藥率，僅對IMP耐藥率較低。篩選出同時對FOX和CAZ耐藥菌株105株。

3.2 三維試驗結果

參見圖1～圖4，三維試驗得到同時產(chǎn)ESBLs與AmpC酶細菌共6株，單產(chǎn)ESBLs菌株26株，單產(chǎn)AmpC酶菌株12株。同時，未測得酶型與陰性結果也較高，分別占20.3%與10.9%（見表2）。

3.3 質粒結合實驗結果

6株三維試驗提示，同時產(chǎn)ESBLs與AmpC酶菌株質粒結合實驗結果為2株細菌結合實驗成功，分別為大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。

3.4 PCR結果

以質粒結合成功2株菌株結合子提取質粒為模板，分別以通用引物SHV、CTX、ACT和TEM、CTX、ACT擴增出陽性結果，并與目標條帶吻合。

4 討論

革蘭陰性桿菌是目前引發(fā)醫(yī)院感染的主要病原體，約占60%～70%[5]。革蘭陰性桿菌耐藥機制復雜，但一致認為，產(chǎn)β-內酰胺酶為革蘭陰性桿菌重要的耐藥機制之一。在所產(chǎn)β-內酰胺酶中，又以ESBLs與AmpC酶最為主要，日益受到大家的關注。

表1 臨床分離革蘭陰性桿菌對抗生素耐藥率情況（%%）Tab 1 Drug resistance rate of clinical isolated gram-negative bacteria to antibiotics（%%）

圖1 三維試驗陰性Fig 1 Negative producing ESBLs of three-dimensional test

圖2 三維試驗ESBLs陽性Fig 2 Positive producing ESBLs of three-dimensional test

圖3 三維試驗AmpC酶陽性Fig 3 Positive producing AmpC of three-dimensional test

圖4 三維試驗同時產(chǎn)ESBLs與AmpC酶陽性Fig 4 Positive producing ESBLs and AmpC of threedimensional test

表2 三維試驗結果統(tǒng)計表Tab 2 Results of modified three-dimensional test

ESBLs是可以水解青霉素類、頭孢菌素與單環(huán)內酰胺類抗生素的一類β-內酰胺酶，主要由質粒介導，因此可在不同菌株之間轉移與傳播[6]。依據(jù)2001年Bradford分類方法[7]，可以把ESBLs分成5類：SHV型、TEM型、OXA型、CTX-M型及其他型。自ESBLs首次報道以來，目前已發(fā)現(xiàn)超200種的ESBLs[8]。AmpC酶與ESBLs不同，通常是由染色體負責編碼。自1988年發(fā)現(xiàn)了首個由質粒介導的源于陰溝腸桿菌的AmpC酶以來，目前共發(fā)現(xiàn)約30種AmpC酶[9]。最近，國內也開始相繼出現(xiàn)發(fā)現(xiàn)質粒介導AmpC酶的報道。朱斌等[10]首次報道了在國內發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中存在有質粒介導CMY-7型AmpC酶。王輝等[11]報道了在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)同時產(chǎn)DHA-1質粒AmpC型及CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌。另外，在大腸埃希菌等菌種中也檢測出新型的AmpC酶亞型[12]。隨著報道的增多，由質粒介導的AmpC酶在細菌之間的傳播趨勢已出現(xiàn)。

SSBLs相較ESBLs與AmpC酶，降解底物譜更加廣泛，水解率更高。實驗結果表明，產(chǎn)SSBLs細菌對除碳青霉烯類之外的所有β-內酰胺類抗生素全耐藥。由于β-內酰胺酶由質粒介導，其耐藥性相較染色體介導更易在不同菌株、菌種乃至不同菌屬中傳播，因此，其研究具有重要的流行病學價值[13]。因此，對產(chǎn)SSBLs菌株的快速、及時檢測，以及對其耐藥譜進行分析，對于防控因其引起的院內感染的傳播流行具有重要的指導意義。近年來，國內許多地區(qū)相繼報道有臨床分離產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌出現(xiàn)[10～20]。但未見本地產(chǎn)SSBLs菌株分離報道。

本研究選擇臨床分離的237株革蘭陰性桿菌作為實驗對象，進行革蘭陰性桿菌臨床分離株耐藥現(xiàn)狀研究，結果表明，本地臨床分離革蘭陰性桿菌耐藥現(xiàn)象嚴重；基于SSBLs具有水解第3代頭孢菌素與頭霉素類的特點，同時篩選出對CAZ與FOX 2種抗生素均耐藥的革蘭陰性桿菌105株，再經(jīng)改良三維試驗、質粒結合實驗和PCR實驗等進行篩選確證。在237株菌中發(fā)現(xiàn)2株產(chǎn)SSBLs細菌，表明本地存在產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌所引起的感染，存在此類菌株在院內傳播流行的可能。產(chǎn)SSBLs的2株細菌均產(chǎn)生至少2類ESBLs，分別為CTX-M、TEM與CTX-M、SHV，與當?shù)匾酝鶊蟮老喾鸞21]；同時，這2株菌株的質粒均含有產(chǎn)生ACT型AmpC酶基因。該結果表明，研究菌株產(chǎn)SSBLs菌株質粒均編碼ACT型AmpC酶，依照不同菌屬染色體AmpC酶的同源關系判斷，該型酶屬于腸桿菌屬群，這是首次報道本地區(qū)發(fā)現(xiàn)質粒編碼AmpC酶。改良三維試驗與PCR法可用于產(chǎn)SSBLs革蘭陰性桿菌篩選與確證。

（致謝：本研究得到了川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院微生物室在菌株收集與鑒定工作中的幫助，謹致謝意?。?/p>

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