趙婷，程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027)

MLSA用于雙歧桿菌快速鑒定研究進(jìn)展

趙婷，程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027)

通過對16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tuf基因部分序列的分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，綜述多位點(diǎn)序列分析技術(shù)（MLSA）用于雙歧桿菌快速鑒定的研究進(jìn)展。

MLSA；雙歧桿菌；基因；鑒定

0 引言

雙歧桿菌是一類革蘭氏陽性，細(xì)胞形態(tài)多變，嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌，被作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品，特別是乳品及嬰幼兒食品中[1]。衛(wèi)生部2010年65號文《可用于食品的菌種名單》中，包含雙歧桿菌屬的7個(gè)種及亞種，因此，規(guī)范食品行業(yè)菌種的管理和評價(jià)程序，建立準(zhǔn)確、快速的雙歧桿菌鑒定體系非常重要。

16S rRNA基因序列分析是分類的重要組成部分，但對親緣關(guān)系比較近的種分辨率不高，相比16S rRNA基因的高度保守性，看家基因具有更高的分化程度，多位點(diǎn)序列分析（Multilocus Sequence Analysis，MLSA）利用多個(gè)基因信息之間的相互比較，綜合分析，可以得到一個(gè)比較全面可信的物種間的關(guān)系，更適用于菌種的分類鑒定[2]。目前，用于雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育分析的看家基因有hsp60，rpoB，atpD，groEL，tuf等。

1 雙歧桿菌屬的分類演變

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是1899年由Tissier從母乳營養(yǎng)嬰兒的糞便中分離得到，1924年Orla-Jensen對其進(jìn)行了修訂，因其細(xì)胞末端常常分叉，故名雙歧桿菌。1929年P(guān)ribram提出的“Tissieria”，1938年P(guān)revot提出的“Bifidibacterium”被認(rèn)為是“Bifidobacterium”的同義詞。雙歧桿菌（Bifidobacterium）包含在1980年SKERMAN等發(fā)表的生效細(xì)菌名稱名錄（Aprroved List of Bacterial Names）中[3]，目前，該屬包含36個(gè)種，9個(gè)亞種，模式種為兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）[4]。

微生物分類是不斷發(fā)展變化的動(dòng)態(tài)過程，尤其是在最近30多年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雙歧桿菌屬內(nèi)一些種也發(fā)生了變遷或者新種的加入，如：2004年，Liesbeth等[5]根據(jù)DNA-DNA雜交、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、atpD及groEL基因序列分析等將乳雙歧桿菌（B.lactis）重新劃分為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（B.animalissubsp.lactis）；2002年Sakata等[6]根據(jù)16S rRNA，hsp60，16S-23S ITS基因序列分析及DNADNA雜交數(shù)據(jù)曾將嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）、豬雙歧桿菌（B.suis）合并進(jìn)長雙歧桿菌（B.longum），統(tǒng)一3個(gè)種為長雙歧桿菌（B.longum）；2008年，Mattarelli等[7]根據(jù)DNADNA雜交、16S rRNA基因序列及hsp60基因序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（RAPD）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）等數(shù)據(jù)，將長雙歧桿菌（B.longum）重新劃分為3個(gè)亞種：長雙歧桿菌長亞種（B.longumsubsp.longum）、長雙歧桿菌嬰兒亞種（B.longumsubsp.infantis）、長雙歧桿菌豬亞種(B.longumsubsp.suis)。2010年，Jiri等[8]發(fā)表了雙歧桿菌屬的兩個(gè)新種B.actinocoloniiforme和B.bohemicum，同年，Min-Soo等[10]發(fā)表了雙歧桿菌屬的一個(gè)新種B.stercoris[9]，Hidetoshi等發(fā)表了雙歧桿菌屬的一個(gè)新種B.kashiwanohense。

2 16S rRNA基因序列分析

Stackebrandt等[11]經(jīng)過大量數(shù)據(jù)分析后提出了種水平的判別標(biāo)準(zhǔn)，同種的16S rRNA基因序列同源性應(yīng)大于97%。圍繞《可用于食品生產(chǎn)的菌種名單》中列出的雙歧桿菌屬菌種（圖1中下劃線所示），從GenBank獲得部分種及亞種模式株的16S rRNA基因序列，選取枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NBRC 13719T作為外群，采用MEGA4.1軟件Kimura模型，鄰位連接法，進(jìn)行1000次相似度重復(fù)計(jì)算并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1），結(jié)果表明：通過16S rRNA基因序列分析，菌株B.longumsubsp.longum、B.longumsubsp.suis、B.longumsubsp.infantis、B.breve聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.6%～99.7%；菌株B.animalissubsp.animalis，B.animalissubsp.lactis，B.choerinum，B.pseudolongum聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.1%～99.3%；菌株B.adolescentis，B. stercoris，B.ruminantium，B.dentium聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.5%～99.4%；B.bifidum單獨(dú)形成一個(gè)分支，且與屬內(nèi)其他種同源性均小于97.0%。

3 雙歧桿菌屬的多位點(diǎn)序列分析（MLSA）

圍繞《可用于食品生產(chǎn)的菌種名單》中列出的雙歧桿菌屬菌種（圖2～圖5中下劃線所示），根據(jù)現(xiàn)行分類體系，從GenBank獲得部分種及亞種模式株的hsp60，rpoB，atpD，tuf基因部分序列，hsp60基因編碼熱休克蛋白（heat-shock protein），rpoB基因編碼RNA聚合酶β亞單位（RNA polymerase β-subunit gene），atpD基因編碼ATP合成酶F1部分的β亞單位（ATP synthase F1 beta subunit），groEL基因編碼groEL蛋白（groEL protein），tuf基因編碼延伸因子Tu（elongation factor Tu），選取Escherichia coli K-12作為外群，采用MEGA4.1軟件Kimura模型，鄰位連接法，進(jìn)行1000次相似度重復(fù)計(jì)算并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，groEL基因因提交的有效序列較少，未構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。部分雙歧桿菌參考菌株如表1所示；用于分析的看家基因PCR引物如表2所示。

hsp60基因序列分析表明（圖2）：菌株B.longum subsp.longum，B.longumsubsp.suis，B.longumsubsp.infantis聚 類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性分別為98.4%，98.8%，98.4%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于94.7%；菌株B.animalissubsp.animalis和B. animalissubsp.lactis聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.6%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于85.7%；菌株B.breve單獨(dú)形成一個(gè)分支，且與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于94.7%；菌株B.adolescentis單獨(dú)形成一個(gè)分支，且與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于92.6%；B.bifidum單獨(dú)形成一個(gè)分支，且與屬內(nèi)其他種同源性均小于92.5%。

rpoB基因序列分析表明（圖3）：菌株B.longumsubsp.longum和B.longumsubsp.infantis聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為98.1%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于95.6%；菌株B.animalissubsp.animalis和B.animalissubsp.lactis聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.5%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于94.3%；菌株B.breve與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于95.0%；菌株B.adolescentis和B.pseudocatenulatum聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.5%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于96.9%；B.bifidum與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于96.3%。

表1 本文涉及的部分雙歧桿菌參考菌株

表2 用于分析的看家基因PCR引物

atpD基因序列分析表明（圖4）：菌株B.longumsubsp.longum，B.longumsubsp.suis，B.longumsubsp.infantis聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性分別為98.7%，97.1%，96.9%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于95.6%；菌株B.animalissubsp.animalis和B.animalissubsp.lactis聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.2%，與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于94.1%；菌株B.breve與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于95.6%；菌株B. adolescentis與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于92.8%；B.bifidum與屬內(nèi)其他種序列同源性均小于94.1%。

tuf基因序列分析表明（圖5）：菌株B.longumsubsp.longum，B.longumsubsp.infantis，B.bifidum聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性分別為96.4%、94.0%、93.0%；菌株B.animalissubsp.animalis，B.animalissubsp.lactis，B.breve，B.magum，B.cuniculi聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性分別為96.4%，93.7%，94.3%，92.8%；菌株B.adolescentis和B.ruminantium聚類在進(jìn)化關(guān)系最近的一個(gè)分支上，且種間序列同源性為97.6%。

16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tuf基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹具有基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在鑒定分辨率上，看家基因hsp60，rpoB，atpD，tuf明顯優(yōu)于16S rRNA基因，《可用于食品生產(chǎn)的菌種名單》列出的雙歧桿菌中除長雙歧桿菌2個(gè)亞種的區(qū)分度較低外，其余均可通過單個(gè)或多個(gè)看家基因進(jìn)行區(qū)分。

長雙歧桿菌（B.longum）亞種間的區(qū)分相對比較困難，長雙歧桿菌嬰兒亞種（B.longumsubsp.infantis）、長雙歧桿菌長亞種（B.longumsubsp.longum）2個(gè)亞種的區(qū)分需要借助于表型特征、RAPD、DGGE、核糖體分型（ribotyping）等鑒定技術(shù)手段[7]。2002年，Sakata等[6]進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果顯示長雙歧桿菌（B.longum）3個(gè)亞種形成有差異的電泳圖譜。2002年，Requena等[12]報(bào)道了長雙歧桿菌（B.longum）3個(gè)亞種形成有差異的DGGE帶型。2006年，Sakata等[13]通過ribotyping分析，發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌（B.longum）3個(gè)亞種形成不同的簇或者亞簇。長雙歧桿菌（B.longum）3個(gè)亞種的糖發(fā)酵特征數(shù)據(jù)如表3所示[7]。

表3 長雙歧桿菌（B.longum）3個(gè)亞種的糖發(fā)酵特征數(shù)據(jù)

4 國內(nèi)外研究狀況

MLSA利用不同基因組位點(diǎn)的保守基因確定細(xì)菌的分類地位，具有快速、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，是細(xì)菌分類發(fā)展的一個(gè)方向。Naser等[15]采用MLSA對已知的腸球菌(Enterococcus)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，這種鑒定方法能將16S rRNA基因序列無法分辨的乳酸菌區(qū)分開來[14]。Naser等應(yīng)用基于pheS和rpoA基因的MLSA等技術(shù)，將Lactobacillus amylophilusLMG 11400和NRRL B-4435重新分類為Lactobacillus amylotrophicus。McTaggart等[16]利用gyrB，16S rRNA，secA1，hsp65，rpoB5個(gè)基因位點(diǎn)序列分析，認(rèn)為MLSA對諾卡氏菌的鑒定比形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)、脂肪酸分析等具有更高的分辨率。Byoung等[17]評估了rpoB基因?qū)τ陔p歧桿菌的分辨率，rpoB基因序列相似度為84.1%～99.0%，可以作為雙歧桿菌鑒定的有效分子標(biāo)簽，并得到了其他分子鑒定工具的支持。蹇文嬰等[18]報(bào)道了利用hsp60基因?qū)﹄p歧桿菌進(jìn)行鑒定的方法，認(rèn)為高度保守和普遍存在的hsp60基因是用于雙歧桿菌鑒定更精準(zhǔn)的分子標(biāo)簽。Ventura等[19]分析了乳桿菌屬和雙歧桿菌屬tuf基因的特征及位點(diǎn)，認(rèn)為tuf基因可替代16S rRNA用于雙歧桿菌鑒定；Sheu等[20]采用基于tuf基因設(shè)計(jì)的引物實(shí)現(xiàn)對雙歧桿菌益生菌部分種的PCR檢測。值得指出的是，當(dāng)時(shí)用于研究的部分菌種其分類學(xué)地位已經(jīng)發(fā)生變遷。

相比16S rRNA基因的高度保守性，具有更高堿基置換率的看家基因更適用于細(xì)菌分類，Zeigler認(rèn)為[21]經(jīng)過精心篩選的少數(shù)看家基因序列的精確度等同于甚至優(yōu)越于DNA同源性分析。Richter等[22]通過對大量細(xì)菌全基因組序列的分析，提出了部分或全部基因組序列ANI（Average Nucleotide Identity）分析作為細(xì)菌分類的金標(biāo)準(zhǔn)，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的DNA雜交分析，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，更嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確的ANI技術(shù)用于細(xì)菌分類也成為可能。

5 結(jié)束語

本文對《可用于食品的菌種名單》中雙歧桿菌的MLSA快速鑒定方法進(jìn)行了總結(jié)，期望為食品行業(yè)企業(yè)的菌種使用提供技術(shù)依據(jù)。在乳品企業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)中，涉及屬于普通食品原料、長期食用安全、且普遍應(yīng)用的微生物菌種遠(yuǎn)不止《可用于食品的菌種名單》所列21種，國際乳業(yè)聯(lián)盟（IDF）《具有在食品中使用記錄史的微生物清單》IDF377中包含110種，其中增加的雙歧桿菌屬菌種為假長雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudolongum），歐洲食品安全局（EFSA）安全資格認(rèn)定（QPS）的微生物名單中包含74種，《可用于食品的菌種名單》中以“傳統(tǒng)上用于食品生產(chǎn)加工的菌種允許繼續(xù)使用”對此進(jìn)行了解釋。

除MLSA外，基于生理生化代謝特征的API 20 A厭氧菌鑒定試劑條，可鑒定青春雙歧桿菌（B.adolescentis）、兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、短雙歧桿菌（B.breve）3個(gè)種，同時(shí)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征觀察也是必要的。另外，《可用于食品的菌種名單》中的嬰兒雙歧桿菌（B. infantis）、乳雙歧桿菌（B.lactis）、乳酸乳球菌雙乙酰亞種（L.lactis subsp.diacetylactis）未采用最新分類學(xué)名稱，筆者認(rèn)為應(yīng)根據(jù)最新的分類學(xué)研究給出規(guī)范的分類學(xué)名稱，同時(shí)可以保留長期沿用的通俗名稱，以體現(xiàn)先進(jìn)性和科學(xué)性。

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Research progress of multilocus sequence analysis(MLSA)for rapid identification of Bifidobacterium species

ZHAO Ting，CHENG Chi
(China National Research Institute of Food&Fermentation Industries,China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100027,China)

This paper reviewed and evaluted the use of 16S rRNA，hsp60，rpoB，atpD，tufgene part sequences as species identification tools forBifidobacterium,Strain sequences were derived from GenBank datebase,Phylogenetic analysis showed that the multilocus sequence analysis(MLSA)approach toBifidobacteriumtaxonomy was possible,and the discriminary of MLSA was higher than 16S rRNA.

MLSA；Bifidobacterium；gene；Identification

Q93-331

B

1001-2230（2011）06-0046-05

2011-03-31

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007BAK36B06)。

趙婷（1980-），女，碩士，從事微生物系統(tǒng)分類學(xué)研究。

程池