陸 佳，肖 良，王倩倩，蔡濱欣，張黎明

(第二軍醫(yī)大學 海醫(yī)系 防化醫(yī)學教研室，上海 200433)

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陸 佳，肖 良，王倩倩，蔡濱欣，張黎明

(第二軍醫(yī)大學 海醫(yī)系 防化醫(yī)學教研室，上海 200433)

利用生物信息學的軟件與方法對已報道的17種海葵溶細胞素的氨基酸組成、理化性質、結構特征以及系統(tǒng)演化關系等進行預測和分析。結果表明不同?？芗毎卦诎被峤M成和理化性質上具有一定相似性，但其在結構上有一定差別。以MP法和NJ法對不同海葵溶細胞素構建的系統(tǒng)發(fā)生樹基本一致，在親緣關系較近的7種?？芗毎刂锌梢哉业?個保守序列。

?？?溶細胞素;生物信息學

?？?Sea anemone)屬于腔腸動物門(Coelenterata)珊瑚綱(Anthozoa)，是一類原始的多細胞動物。海葵毒素是一類具有溶血、細胞毒、心臟毒、膜去極化和鉀離子通道阻滯等生物毒性的多肽類毒素。溶細胞素是?？舅刂醒芯枯^為深入的一類活性組分［1-5］。本文擬利用生物信息學的軟件與方法對目前已報道的17種來源不同的?？芗毎氐陌被峤M成和序列、理化性質、結構特征以及系統(tǒng)演化關系等進行預測和分析，以期為深入開展該類蛋白質的相關研究提供理論指導。

1 材料和方法

通過檢索，從NCBI蛋白質數(shù)據(jù)庫中篩選得到Actinoporin Or-A等17種?？芗毎刈鳛榉治鰧ο?見表1)。

表1 17種海葵溶細胞素序列

利用BioEdit等多種生物信息學軟件(見表2)對17種?？芗毎氐鞍仔蛄械陌被峤M成、理化性質、結構特性及分子系統(tǒng)進化關系等進行分析和預測。

2 結果

2.1 氨基酸組成、理化特性以及信號肽與跨膜結構域的預測

分析發(fā)現(xiàn)不同海葵溶細胞素的氨基酸組成具有一定相似性(見表3):①非極性氨基酸以Gly、Ala、Leu和 Val等4種含量豐富;②極性氨基酸以Lys、Tyr和Ser等3種含量豐富。③Cys含量極低，除信號肽區(qū)域外該毒素中不含有Cys。

不同海葵溶細胞素理化性質、信號肽及跨膜結構域有如下特點:①毒素相對分子質量(Mr)范圍15 000～29 800，長度165～276個氨基酸，功能域長度約170個氨基酸;②除Src I和RTX-SⅡ為酸性蛋白外，其余毒素等電點均大于7，為堿性蛋白;③含有長度約20個氨基酸的信號肽，部分含信號肽的毒素中含有長約10～20個氨基酸的“Propeptide”序列;④除 Avt-1、EqTV、Src I、PsTX-20A 和 HMgⅢ這5 種?？芗毎睾锌缒そY構外，其余12種溶細胞素不含跨膜結構。

表2 主要分析軟件［6］

表3 海葵溶細胞素的理化性質、信號肽及跨膜結構域的分析

2.2 不同?？芗毎厥杷?親水性預測

海葵溶細胞素的疏/親水性有明顯差異，可分為3組:第1組包括Actinoporin Or-A等13種溶細胞素，其結構中均有1個長約30個氨基酸的疏水區(qū);第2組包括Avt-1、PsTX-20A和Bandaporin等3種，含有2個長度均為25個氨基酸的疏水區(qū);第3組僅Echt 2這1種，含有2個長度分別為50和25個氨基酸的疏水區(qū)域。

2.3 二級結構預測

預測發(fā)現(xiàn)?？芗毎囟壗Y構相似性較高。如表4所示，除Echt2外，含量最多的是無規(guī)則卷曲，其次為β-折疊和α-螺旋，而Echt2中含量最高的是α-螺旋，其次為無規(guī)則卷曲和β-折疊。β-轉角散布于溶細胞素整個蛋白分子內(nèi)。

表4 不同?？芗毎囟壗Y構預測

2.4 不同?？芗毎囟嘀匦蛄斜葘Α⒎肿舆M化及保守序列的分析

對?？芗毎剡M行親緣分析，發(fā)現(xiàn)Actinoporin Or-A、Actinoporin Or-G、Bandaporin、EqTⅡ、EqTⅣ、EqTⅤ、Fra C、HMgⅢ、RTX-A、RTX-SⅡ、StⅠ、StⅡ、Tenebrosin-C 等 13 種毒素親緣關系較近，用MP法和NJ法分別構建了分子系統(tǒng)進化樹(圖1)。

圖1 ?？芗毎叵到y(tǒng)進化樹

結果表明，不同的建樹方法，所建分子系統(tǒng)進化樹是相似的。根據(jù)NJ法的建樹結果，在Actinoporin Or-A、Actinoporin Or-G、HMgⅢ、RTX-A、RTX-SⅡ、StⅠ和 StⅡ等 7 種毒素中尋找保守序列，發(fā)現(xiàn)其含 VSRKIA、DNESGG、NAYFRSGTTDVILP、KALLY、YSNWW和RRADQ等6段保守序列(圖2)。

2.5 不同海葵溶細胞素空間結構預測

不同?？芗毎卦诳臻g結構上十分相似，多為β-折疊及α-螺旋兩者間以 β-轉角連接。其信號肽和“Propeptide”的序列多以α-螺旋形式存在，在毒素N端含有雙親螺旋，推測與結合膜蛋白發(fā)揮溶細胞毒性有關。

圖2 ?？芗毎氐鞍仔蛄卸嘀貙Ρ?/p>

3 討論

隨著傳統(tǒng)生物學研究的不斷深入和發(fā)展，生物信息學作為一門新興學科，在生物學各領域中越來越常用。雖然生物信息學分析預測的方法是建立在對大量已知數(shù)據(jù)的分析模擬基礎上的，與實驗結果可能存在一定的偏差，但在課題研究前期，生物信息學的方法對揭示生物分子自身所帶的信息、規(guī)律及生物大分子間的關系有重要作用［7］。本文主要利用生物信息學方法對已報道的17種海葵溶細胞素的氨基酸組成、理化性質、結構特征以及系統(tǒng)演化關系等進行了預測分析。結果表明，不同海葵溶細胞素在結構上存在相似性，這樣的相似性是其具有相似毒性作用的物質基礎。根據(jù)本文分析結果并結合相關文獻報道可以看出，?？芗毎貫橐活怣r約20 000的分泌蛋白，除個別為酸性蛋白外，多數(shù)為堿性蛋白;是一類真核生物膜孔道形成毒素(pore-forming toxin)，能夠與血細胞、腫瘤細胞、血小板、纖維原細胞及人工脂膜相結合，在膜上形成直徑為1.0～2.0 nm的離子選擇性通道［8］。在膜孔形成的過程中，毒素的正電荷與磷脂雙分子層表面負電荷相互吸引靠近;毒素結構中富含Lys、Tyr、Ser等極性氨基酸的區(qū)域與細胞膜結合，N端氨基酸形成的雙親螺旋區(qū)插入膜內(nèi)，達一定濃度后毒素蛋白即可結合形成三或四聚體形成陽離子通道從而發(fā)揮毒性作用［9］。若切除毒素N端的氨基酸可發(fā)現(xiàn)隨著切除的氨基酸數(shù)目的增加，毒素蛋白的溶解性和溶血能力均降低，但其對鞘磷脂和血紅細胞的結合能力卻增強，說明海葵溶細胞素保守的N端與該毒素蛋白的溶解性、膜孔形成有關，但并不是膜結合所必須的［10］。綜合上述分析，可以看出文獻已報道的研究結果和本文利用生物信息學方法分析的結果是吻合的，提示我們可以反過來運用生物信息學方法分析、預測的結果來指導具體的實驗研究工作。在對?？芗毎氐姆治鲋形覀儼l(fā)現(xiàn)一些保守區(qū)域，這些保守區(qū)除短肽RGD已有相關研究報道外，其余均未見報道，這些信息對我們進一步深入研究海葵溶細胞素的作用機制及相關防護措施和救治藥物具有一定指導意義?？梢灶A測，隨著生物信息學理論和技術的飛速發(fā)展，利用生物信息學方法對生物大分子的結構和功能進行分析將會成為生物分子前期研究中常規(guī)的技術手段。

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Bioinformatic analysis on sea anemone hematoxins

LU Jia，XIAO Liang，WANG Qian-qian，CAI Bin-xin，ZHANG Li-ming
(Department of Chemical Defense Medicine，F(xiàn)aculty of Naval Medicine，No.2 Military Medical University，Shanghai 200433，China)

R282.76

A

1005-1678(2011)04-0332-04

2010-04-30

上海市自然科學基金(10ZR1437900)

陸 佳，女，軍事預防醫(yī)學專業(yè)碩士研究生;張黎明，通信作者，E-mail:lmzhang1969@yahoo.com.cn。