崔曉雪，顧 曄

(華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬普愛醫(yī)院 心內(nèi)科，湖北 武漢 430034)

原發(fā)性高血壓是引起動(dòng)脈粥樣硬化的常見原因，以往認(rèn)為內(nèi)膜損傷是動(dòng)脈粥樣硬化性病變的基礎(chǔ)，外膜僅起支持、營養(yǎng)作用。但近年研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)損傷反應(yīng)活躍的細(xì)胞絕大多數(shù)存在于血管外膜，其中成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在高血壓動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要的作用[1]。本研究觀察銀杏葉提取物(GBE)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響，為臨床防治動(dòng)脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

GBE注射液(金納多，每支5 mL，含 GBE 17.5 mg;批號(hào):2007122721)，德國威瑪舒培博士藥廠;DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司;胎牛血清，Costar公司;血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、胰蛋白酶，Sigma公司;α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。

FACSVantageSE型流式細(xì)胞儀。

清潔級(jí)SHR，雄性，8周齡，體重(200±10)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SHR 6只，用大鼠尾動(dòng)脈血壓計(jì)測(cè)定大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，血壓均達(dá)到21.3 kPa以上。常規(guī)處死，取胸主動(dòng)脈，去除血管周圍組織，分離出血管外膜。剪成1 mm3組織塊，平鋪于25 mL培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)使瓶底在上，向培養(yǎng)瓶內(nèi)添加含有20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3 mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱貼壁4 h，之后小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使貼壁細(xì)胞浸于DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d換液一次。5～7 d后待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)用含0.02%EDTA的胰酶消化傳代，采用差速貼壁法純化成纖維細(xì)胞，第4～6代細(xì)胞用于試驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組，GBE 25，50，100 mg/L劑量組，每組均為6個(gè)樣本，每瓶細(xì)胞培養(yǎng)體積3 mL。各組先給予終濃度為10－6mol/L的 AngⅡ刺激30 min，再分別換為含不同濃度GBE(終濃度分別為25，50和100 mg/L)的DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h。對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)基。

2.2 GBE對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以1×104個(gè)/孔的第4～6代成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，加無血清 DMEM培養(yǎng)基100 μL，37℃孵育24 h，使細(xì)胞生長同步化后加入AngⅡ(10－6mol/L)刺激30 min，換不同濃度GBE(終濃度分別為25，50和100 mg/L)DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)基。20 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩混勻 10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定490 nm波長處的吸光度值。

2.3 RT-PCR法檢測(cè)α-SMA mRNA

收集各組細(xì)胞，用Trizol試劑盒抽提總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃ 60 s預(yù)變性，95℃ 15 s、60℃ 60 s，共 40個(gè)循環(huán)。α-SMA引物序列:正義鏈 5'-GCAGGGGACAGAGGGACTTG-3';反義鏈 5'-GAGGCCATCGCTGCACTCA-3'。以GAPDH作內(nèi)參照，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。α-SMA mRNA表達(dá)水平用所測(cè)定的α-SMA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶密度與GAPDH電泳條帶密度的比值表示。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)α-SMA

胰蛋白酶消化貼壁的成纖維細(xì)胞，4℃，75%乙醇溶液固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá) α-SMA的XMode值，以反映單個(gè)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的量，每份樣品含5×105個(gè)細(xì)胞。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 血管外膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)長出的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型確定為成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞有一個(gè)核或多個(gè)核，邊界清楚，折光率較高，以梭形細(xì)胞為主，也有三角形、多角形細(xì)胞，連接成網(wǎng)(圖1)。

圖1 培養(yǎng)的第4代外膜成纖維細(xì)胞(400×)

3.2 GBE對(duì)細(xì)胞增殖的影響

在培養(yǎng)24 h時(shí)，MTT法，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在490 nm波長處的吸光度(A)值，GBE 25，50，100 mg/L劑量組的 A值分別為(0.843 ±0.110)，(0.824 ± 0.121)，(0.815 ± 0.091)，與對(duì)照組的(0.853 ±0.122)比較，均無顯著差異(P ＞0.05)。

3.3 GBE對(duì)SHR血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá) α-SMA的影響

結(jié)果見表1。25，50，100 mg/L組成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA mRNA和α-SMA蛋白值均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);隨GBE濃度增高，各組細(xì)胞 α-SMA mRNA和單個(gè)細(xì)胞α-SMA表達(dá)值降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 GBE對(duì)SHR血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響(n=6，)

表1 GBE對(duì)SHR血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響(n=6，)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05，2P＜0.01;與25 mg/L時(shí)比較:3P＜0.05;與50 mg/L時(shí)比較:4P ＜0.05

組 別 濃度 α-SMA mRNA α-SMA(X-Mode)/(mg/L)對(duì)照組 － 1.74 ±0.16 425.42 ±19.73 GBE 組 25 1.36 ±0.121 358.26 ±12.551 50 0.82 ±0.071，3 316.41 ±10.121，3 100 0.61 ±0.052，4 276.59 ±11.832，4

4 討論

血管主要由內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞、中膜的平滑肌細(xì)胞、外膜的成纖維細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。近年研究表明，外膜的成纖維細(xì)胞在高血壓等刺激下表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)，其標(biāo)志性蛋白是α-SMA[2]，細(xì)胞進(jìn)而發(fā)生增殖、遷移、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，參與血管新生內(nèi)膜的形成[3]。

本研究觀察了GBE對(duì)SHR血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的影響，結(jié)果顯示:①25～100 mg/L的GBE均能抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA mRNA，且抑制作用呈濃度依賴性增強(qiáng);②流式細(xì)胞儀檢測(cè)單個(gè)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的結(jié)果顯示，25～100 mg/L GBE組的單個(gè)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的均值均明顯低于對(duì)照組，與濃度成反比，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示GBE在基因水平和蛋白水平均顯示出對(duì)血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的抑制作用。分析可能機(jī)制為:從銀杏葉中提取的GBE是一種天然活性物質(zhì)，其有效成分為黃酮苷及銀杏內(nèi)酯[4]，黃酮苷具有清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的作用，所以能部分中和MF合成分泌腫瘤壞死因子、一氧化氮等的炎性介質(zhì);銀杏內(nèi)酯是一種特異而有效的血小板活化因子受體拮抗劑，能抑制血小板聚集，防止血栓形成，且對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。總之，GBE能抑制原發(fā)性高血壓大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，對(duì)防止血管壁增厚和硬化有一定作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]李 莉，高平進(jìn)，沈偉利，等.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞遷移活性涉及P38MAPK[J].中華心血管病雜志，2005，33(6):557-560.

[2]Zhou H Y，Chen W D，Zhu D L，et al.The PDE1A-PKCalpha sig-naling pathway is involved in the upregulation of alpha-smooth muscle actin by TGF-beta1 in adventitial fibroblasts[J].J Vasc Res，2010，47(1):9-15.

[3]車在前，高平進(jìn)，姬開達(dá)，等.重組結(jié)締組織生長因子對(duì)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響[J].中國病理生理雜志，2006，22(12):2317-2321.

[4]李相軍，王 丹，石 艷，等.銀杏葉提取物對(duì)體外培養(yǎng)大鼠腎成纖維細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14(1):45-47.