李新蘋(píng)，劉歡歡，普燕，張富春，李軼杰

（新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

重組凝乳酶原在大腸桿菌中的表達(dá)及活性研究

李新蘋(píng)，劉歡歡，普燕，張富春，李軼杰

（新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

為了提高干酪生產(chǎn)中起重要凝乳作用的凝乳酶的原核表達(dá)效率，分析了Genbank中牛、羊和駱駝凝乳酶原（prochymosin，pCHY）的保守序列及大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性，合成了凝乳酶原序列，并將其克隆至大腸桿菌原核表達(dá)載體上。經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)得到高效表達(dá)的凝乳酶原；Western blotting檢測(cè)證明了其具有免疫原性；經(jīng)pH值2到6活化后成功自剪切，得到大小約36 ku的有凝乳活性的凝乳酶。研究獲得較高表達(dá)水平具有凝乳活性的重組凝乳酶。

凝乳酶原；密碼子優(yōu)化；凝乳活性

0 引 言

凝乳酶以凝乳酶原（prochymosin，pCHY）的形式分泌，在酸性條件下自剪切成有活性的凝乳酶[1]，其傳統(tǒng)來(lái)源是乳牛的皺胃，不但適于制造各種類(lèi)型的干酪，還是衡量其它凝乳酶代用品的標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)凝乳酶生產(chǎn)還沒(méi)產(chǎn)業(yè)化[2]，其性質(zhì)及代用品的研究對(duì)我國(guó)干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的意義。基因工程菌可高效表達(dá)凝乳酶，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者應(yīng)用多種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了研究，如曲霉[3]， 畢赤酵母[4，5]，乳酸克魯維酵母[6]，乳酸乳球菌[7]，大腸桿菌[8，9]等。基因工程菌用于工業(yè)化生產(chǎn)其首要前提是凝乳酶原基因有較高的表達(dá)效率，所以本研究根據(jù)牛、羊和駱駝的凝乳酶原保守序列及大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性合成了凝乳酶原基因，實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌的高效表達(dá)，為凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pGEX-4T-1，菌種E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）。

1.1.2 試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，DNA聚合酶，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，羊抗兔IgG-HRP抗體，天然凝乳酶，其余均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)http：//www.kazusa.or.in/codon對(duì)E.coli編碼氨基酸的密碼子使用頻率的分析，綜合幾種凝乳酶原基因，對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，送至上海生工公司合成相應(yīng)的基因序列。將PCR擴(kuò)增并回收的pCHY基因用EcoR I和Xho I雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物連到同樣酶切回收的pGEX-4T-1載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α篩選重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子并提取重組質(zhì)粒，再進(jìn)行PCR及酶切鑒定。選擇酶切正確且PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用于構(gòu)建E.coli BL21（DE3）pGEX-4T-1-pchy工程菌。

1.3 重組凝乳酶原基因在E.coli BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取pCHY+的單個(gè)菌落，接種于新鮮LB培養(yǎng)基（含Amp+50 mg/L）中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按1%的接菌量接至新鮮LB培養(yǎng)基（含Amp+50 mg/L）中。當(dāng)0D600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，在其中加入濃度為0.08 mmol/L的IPTG，在37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)后E.coli BL21（DE3）的菌體，PBS洗滌后進(jìn)行全細(xì)胞蛋白SDSPAGE電泳，觀察蛋白表達(dá)情況。

1.4 pCHY蛋白的提取[10]

將得到的菌體沉淀洗滌后，用濃度為8 mol/L的尿素[11]溶解，復(fù)性后，加入GSH/GSSG透析。

1.5 重組牛凝乳酶原的Western blotting[12]

將表達(dá)的融合蛋白GST-pCHY經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以3%BSA封閉過(guò)夜，依次與核酸疫苗制備的兔抗pCHY抗血清、山羊抗兔IgG-HRP分別室溫反應(yīng)1 h，PBST洗滌3次后，加入DAB顯色并拍照。

1.6 重組牛凝乳酶原的活化和凝乳活性

將GST-pCHY蛋白溶液的pH用2mM HCl調(diào)整至2.0，室溫下放置2 h，然后用1M Tris緩沖液（pH8.0）將蛋白溶液的pH回調(diào)至6.0，SDS-PAGE分析凝乳酶原的活化情況。

按照孫大慶等[7]的方法，在一個(gè)96孔板中，每孔100 μL的檢測(cè)混合液包括10%的脫脂乳粉、Ca2+、pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液和活化后的凝乳酶，35℃ 孵育30 min。96孔板倒置于吸水紙上，除去未凝固的上清。與天然凝乳酶比較，計(jì)算重組凝乳酶的凝乳活性[13]。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)載體pGEX-4T-1-pchy的鑒定

表達(dá)載體pGEX-4T-1-pchy經(jīng)EcoRI和Xho I酶切和PCR鑒定（如圖1），均得到約1.1 kb的片段，與理論值大小相符。取鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與合成的對(duì)應(yīng)序列完全一致，表明表達(dá)載體pGEX-4T-1-pchy構(gòu)建成功。

2.2 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的E.coli BL21（DE3）/pGEX-4T-1-pchy的轉(zhuǎn)化子在新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)收集轉(zhuǎn)化菌，如圖2所示。離心后取上清和沉淀分別留樣。菌體沉淀用PBS洗滌，并用細(xì)胞裂解液處理后進(jìn)行超聲，直至菌體不再粘稠，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。 結(jié)果表明，在E.coli BL21（DE3）中構(gòu)建的工程菌表達(dá)了帶有GST標(biāo)簽的約67 ku大小的外源蛋白，與理論大小一致，且以包涵體的形式存在，表達(dá)量較高，初步表明對(duì)pCHY基因密碼子的優(yōu)化是成功的。

2.3 重組牛凝乳酶原的Westernblotting檢測(cè)

對(duì)包涵體溶解并透析后的GST-pCHY蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)（如圖3所示），在67 ku處出現(xiàn)了一條比較特異的條帶，表明GST-pCHY包涵體蛋白經(jīng)變性復(fù)性后具有免疫原性，即初步表明GST-pCHY蛋白復(fù)性后恢復(fù)了其免疫活性。

2.4 重組牛凝乳酶原活化和凝乳活性分析

將GST-pCHY蛋白溶液酸化后恢復(fù)其pH值至6.0，分別取pH恢復(fù)前和恢復(fù)后留樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。由圖4可以看出，與復(fù)性后的蛋白相比，經(jīng)酸化處理后，67 ku處的條帶消失，在約36 ku處出現(xiàn)了特征性條帶，初步表明對(duì)凝乳酶原的活化成功。

將凝乳酶原活化后，選擇測(cè)定凝乳活力的脫脂乳最佳濃度[14]，加入96孔板中，進(jìn)行凝乳活性檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，質(zhì)量濃度為10 g/L的天然凝乳酶的凝乳活力為133.3個(gè)Soxhlet單位（SU），重組凝乳酶可達(dá)26.7個(gè)SU，相當(dāng)于每mL含有2 mg天然凝乳酶。

3 討 論

大腸桿菌作為宿主，表達(dá)的包涵體蛋白產(chǎn)量高，易于分離，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。E.coli對(duì)編碼同一種氨基酸的各種密碼子的使用具有偏愛(ài)性，使用其常用的密碼子，可以提高重組蛋白的表達(dá)水平[15]。袁偉，馮鎮(zhèn)[16，17]等采用了乳酸克魯維酵母中高度或中度使用頻率的密碼子對(duì)牛凝乳酶原基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使難以在乳酸克魯維酵母中高效表達(dá)的基因得到表達(dá)。MENZELLA H.G.[18]表明，對(duì)大腸桿菌中基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)，密碼子隨機(jī)選擇比一個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)一個(gè)密碼子表達(dá)的凝乳酶的產(chǎn)量高。本研究利用該系統(tǒng)，優(yōu)化了凝乳酶原基因的密碼子，表達(dá)了具有生物活性的凝乳酶原，活化后凝乳效果顯著。

本研究不但分析了大腸桿菌中密碼子的使用頻率，同時(shí)還綜合了牛、羊、駱駝這些主要?jiǎng)游飦?lái)源的凝乳酶原的基因序列，以期在干酪生產(chǎn)中產(chǎn)生更好的凝乳效果及風(fēng)味。牛凝乳酶具有較高的凝乳活性和較低的蛋白水解活性，是優(yōu)先選用的凝乳酶。但牛凝乳酶不能使生駝乳凝固，研究表明駱駝凝乳酶的凝乳活性比牛凝乳酶高70%，非特異性的蛋白水解活力只相當(dāng)于牛凝乳酶的20%，耐熱性更好[19]。而山羊凝乳酶比牛凝乳酶更耐熱且更穩(wěn)定[20]，已有研究者完成了對(duì)其的克隆[21]，重組羔羊凝乳酶制造的奶酪與重組牛凝乳酶有相似品質(zhì)[22]。對(duì)本研究得到的凝乳酶進(jìn)行凝乳實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，它可以使生駝乳凝固。

凝乳酶原除了可用于制作干酪外，有研究者也關(guān)注于凝乳酶原的自剪切作用，將其與標(biāo)簽蛋白基因構(gòu)建在一起，通過(guò)自剪切作用切除標(biāo)簽蛋白，得到單純的靶蛋白，拓展了凝乳酶原的應(yīng)用范圍[23]。本文利用凝乳酶原的這一優(yōu)勢(shì)來(lái)切割標(biāo)簽蛋白，得到有活性的凝乳酶，從而簡(jiǎn)化蛋白純化的程序。同時(shí)，在純化凝乳酶方面我們也通過(guò)超濾等技術(shù)進(jìn)一步的探索，以期得到純度高的凝乳酶。

本研究在大腸桿菌系統(tǒng)中通過(guò)優(yōu)化密碼子，得到了高效表達(dá)的凝乳酶原，可以為我國(guó)大規(guī)模生產(chǎn)凝乳酶提供優(yōu)良的菌株，使我國(guó)擁有自主產(chǎn)權(quán)的凝乳酶，從而擺脫依賴(lài)進(jìn)口的現(xiàn)狀，具有良好的應(yīng)用前景。

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Expression of recombinant prochymosin in E.coli and research on its activity

LI Xin-ping,LIU Huan-huan,PU Yan,ZHANG Fu-chun,LI Yi-jie
（College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China）

Chymosin plays an important role in clotting milk when manufacturing cheese.Aim to improve the expression of recombinant chymosin,we analyzed the conserve sequence of buffalo,lamb,camel in Genbank and the optimal codons of E.coli,synthesized the sequence of prochymosin.The gene encoding prochymosin has been cloned and hyperexpressed in E.coli BL21（DE3）after IPTG induction.Western blotting indicates the prochymosin protein has antigenicity.SDS-PAGE shows it could autocatalytically clip at acidic pH,and activited chymosin which is about 36 ku shows milk clotting activity.The recombinant chymosin which could make milk clotting has high level expression.

prochymosin;optimal codons;clotting milk

Q789，Q936

A

1001-2230（2011）09-0014-03

2011-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（30860265）;新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（XJDX0201-2010-2）。

李新蘋(píng)（1986-），女，碩士，研究方向?yàn)樯c分子生物學(xué)。

李軼杰