傅松哲,高建新,陳海嬰,張悅,劉纓,倪賢生

（1.南昌市疾病預防控制中心，南昌 330038；2.中國科學院微生物研究所,北京 100101）

紫外線-乙醇聯(lián)合使用對克洛諾菌屬的協(xié)同殺菌效果

傅松哲1,高建新1,陳海嬰1,張悅1,劉纓2,倪賢生1

（1.南昌市疾病預防控制中心，南昌 330038；2.中國科學院微生物研究所,北京 100101）

為探討紫外線-乙醇聯(lián)合使用是否對克洛諾菌屬產(chǎn)生協(xié)同消毒效果，對0.1%稀釋復原嬰兒配方奶粉分別用乙醇，氫氧化鈉和紫外線對克洛諾菌屬NC830的殺菌效果進行了調查。結果表明，體積分數(shù)為50%和25%的乙醇處理僅引起3.65和4.05 mL-1的殺滅效果，而使用體積分數(shù)為75%的乙醇，阪崎克洛諾菌的水平下降5.46 mL-1（對數(shù)值）。質量分數(shù)為1.0%，2.5%，5.0%的氫氧化鈉殺滅效果分別達到4.84，5.44和6.46mL-1（對數(shù)值）。 紫外線分別作用克洛諾菌屬10，20，30 min，殺滅效果分別達到1.14，2.03和2.89 mL-1（對數(shù)值）。 經(jīng)過30 min的處理，紫外線、乙醇和兩者聯(lián)合使用對阪崎克洛諾菌殺滅值分別為2.81，3.85和5.07 mL-1（對數(shù)值），紫外線-乙醇聯(lián)合使用對阪崎克洛諾菌產(chǎn)生協(xié)同消毒效果。

克洛諾菌屬；嬰兒配方乳粉；紫外線；協(xié)同效果

0 引 言

克洛諾菌屬導致新生兒出現(xiàn)腦膜炎和敗血病等癥狀，致死率可高達50%[1]。2008年，阪崎腸桿菌正式從腸桿菌屬中劃出[2],并命名為克洛諾菌屬（Cronobacter）。一項由7個國家參與的國際調查顯示高達12%嬰兒奶粉中均檢出克洛諾菌屬[3]?？寺逯Z菌屬在食品加工廠及食品中均被分離出[4]。

Hein等人發(fā)現(xiàn)，克洛諾菌屬廣泛分布在乳粉生產(chǎn)區(qū)和非生產(chǎn)區(qū)[5]。重復利用的腸內喂養(yǎng)管和回用袋增加了微生物感染的危險[6]?？寺逯Z菌屬能夠在不銹鋼等多種載體上形成生物膜[7]。傳統(tǒng)的消毒措施并不能完全達到效果[8]。

乙醇和紫外線聯(lián)合使用對金黃色葡萄球菌等常見致病菌有明顯殺菌效果[9]，然而Jo等人并沒有觀察到其具有協(xié)同殺菌的效果[10]。在本文中，我們將探索聯(lián)合使用乙醇和紫外線對材料表面克洛諾菌屬的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種：坂崎克洛諾菌標準株ATCC29544（Cronobacter sakazakii）； 菌株NC830（Genbank登錄號GU727683）。

（2）培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水，LB，TSB，TSA培養(yǎng)基和微量生化管。結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）， 顯色培養(yǎng)基 （Xa-GicA、DFI）。Dey-Engley（DE）中和劑肉湯?？Х龋?+2型），全脂牛奶和低脂肪牛奶，脫脂牛奶，嬰幼兒配方奶粉。

（3）其他材料：紫外燈（型號ZW40S23W），紫外線波長為253.7 nm，1m輻射照度實測為98 μw/cm2；24孔板及96孔板。

1.2 方法

1.2.1 懸液定量滅菌試驗

克洛諾菌屬懸液定量滅菌試驗參考Kim等人的方法[8]。將標準株ATCC29544和菌株NC830采用24 h新鮮斜面培養(yǎng)物,用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗下菌苔并進行稀釋制備成所需濃度試驗菌懸液。將嬰幼兒配方奶粉用滅菌蒸餾水溶解，配制成0.1%的濃度，1×105Pa滅菌30 min，將菌懸液0.2%嬰幼兒配方奶以等體積混合（終濃度為0.1%）。準備24孔板，加入2 mL消毒液（陽性對照為PBS）于20℃水浴中恒溫,然后在每孔加入菌液0.5 mL立即混勻;作用至規(guī)定時間,取出2 mL加到含2 mL兩倍濃度的Dey-Engley（DE）中和劑肉湯試管內,混勻;中和作用10 min。取樣液1 mL采用0.1%蛋白胨水進行梯度稀釋，取0.5 mL作傾注平板,36℃培養(yǎng)48 h，進行活菌計數(shù),計算滅菌率。試驗重復3次。

1.2.2 生物膜檢測

利用生物膜內物質對結晶紫的結合,通過結晶紫染色的辦法對生物膜進行定量，參考Wakimoto等人的方法[11]。將已形成穩(wěn)定生物膜的96孔板用蒸餾水沖洗3次,洗去菌懸液,用福爾馬林固定5 min,結晶紫染色15 min,再用蒸餾水沖洗3次。放置干燥后用400 μL體積分數(shù)為95%乙醇脫色30 min,所得有色溶液稀釋至1 mL用分光光度計測595 nm處吸光值。

1.2.3 紫外線殺滅效果試驗

將上述準備的24孔板中加入菌液0.5 mL，放入紫外燈正下方1 m處，加入體積分數(shù)75%乙醇或滅菌蒸餾水0.5 mL，作用至規(guī)定時間,取出采用0.1%蛋白胨水進行梯度稀釋，取0.5 mL加入平板，TSA培養(yǎng)基傾注,36℃培養(yǎng)48 h，進行活菌計數(shù),計算滅菌率。試驗重復3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用SPSS11.5軟件進行。

2 結 果

2.1 不同培養(yǎng)基對克洛諾菌生物膜生長影響

圖1為不同培養(yǎng)基對克洛諾菌屬ATCC29544和NC830生物膜形成能力的影響。由圖1可以看出，對于不同培養(yǎng)基，坂崎克洛諾菌生物膜生長量整體次序為：低脂牛奶和全脂牛奶＞重組嬰幼兒配方奶粉＞脫脂牛奶＞咖啡＞LB培養(yǎng)液 ＞果汁＞0.1%蛋白胨水＞酸奶。非常值得注意的是所有克洛諾菌屬生長在重組嬰兒配方奶粉和全脂牛奶中均好于傳統(tǒng)的LB和TSB培養(yǎng)液，表明各種配方奶粉都為克洛諾菌屬的生長提供了更好的條件，被污染后食品安全風險極高。而pH值低的酸奶風險較低。因此，生產(chǎn)設備中殘留的微量牛奶都可以為克洛諾菌屬的生長提供良好的培養(yǎng)基，并在設備表面形成不易去除的生物膜，進而污染下一批的產(chǎn)品。

圖1中，橫坐標FJ為果汁;OJ為橙汁;BP為緩沖蛋白胨水;Y為酸奶;SM為脫脂牛奶;WM為全脂牛奶;LFM為低脂肪牛奶；CM為咖啡混合;IF為嬰兒配方奶粉。

表1 紫外線照射對標準菌株和野生株的影響

2.2 紫外線、NaOH和乙醇對菌懸液的殺滅效果

結果表明,采用1 m輻射照度為110 μw/cm2的紫外線分別作用ATCC29544菌株10，20，30 min，照射劑量分別為555，1110和1665 mW·min/cm2。殺滅效果分別達到1.14、2.03和2.89mL-1（對數(shù)值）。對于菌株NC830紫外線的殺滅效果也非常接近。由于紫外線對標準菌株和菌株NC830幾乎沒有差別，因此為更加了解乳粉加工環(huán)境中消毒劑的殺滅效果，以下均采用野生菌株NC830進行試驗。體積分數(shù)50%和25%的乙醇處理僅引起3.65和4.05mL-1（對數(shù)值）的殺滅效果，而使用體積分數(shù)為75%的乙醇，阪崎克洛諾菌的水平下降了5.46 mL-1（對數(shù)值）。氫氧化鈉的殺滅效果好于乙醇（P＜0.05）， 質量分數(shù)分別為1.0%，2.5%，5.0%的氫氧化鈉殺滅效果分別達到4.84，5.44和6.46 mL-1（對數(shù)值）。經(jīng)過10 min的處理，質量分數(shù)為5%的氫氧化鈉效果最強。但與質量分數(shù)為1%和2.5%的氫氧化鈉相比，效果并不顯著（P＞0.05）。

2.3 NaOH和乙醇對生物膜的殺滅效果

NaOH和乙醇對克洛諾菌2 d和6 d生物膜的殺滅效果如圖4和圖5所示（結果以OD595值平均值及其標準偏差來表示）。分別將克洛諾菌接種至24孔板內，培養(yǎng)至規(guī)定時間棄去菌懸液，分別加入終體積分數(shù)為25%，50%和75%的乙醇和質量分數(shù)1%，2.5%和5%的氫氧化鈉。采用OD595值表征消毒劑對生物膜的破壞作用。經(jīng)過30 min的處理，乙醇分別使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值下降0.38和0.64，顯著高于體積分數(shù)25%和50%乙醇的處理效果。質量分數(shù)1%，2.5%和5%的氫氧化鈉均使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)過10min的處理，3種質量分數(shù)的氫氧化鈉均使克洛諾菌2 d和6 d生物膜OD595值下降約0.3，經(jīng)過30 min的處理，質量分數(shù)為5%的氫氧化鈉效果最強，分別使2天和6天生物膜OD595值下降0.336和0.812。但與1%和2.5%的氫氧化鈉相比，效果并不顯著。值得注意的是體積分數(shù)為75%的乙醇和質量分數(shù)為1%，2.5%和5%的氫氧化鈉對克洛諾菌生物膜的破壞作用并沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.4 乙醇和紫外線聯(lián)合使用對克洛諾菌的殺滅效果

乙醇、紫外線和兩者聯(lián)合使用的殺滅效果如圖6所示。經(jīng)過30 min的處理，3種方法對阪崎克洛諾菌殺滅值分別為2.81，3.85和5.07mL-1（對數(shù)值）。 乙醇和紫外線聯(lián)合使用作用10，20和30 min，均高于單獨使用的效果。

3 討 論

利用紫外線對農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境進行消毒已經(jīng)有很多應用實例[12]。在各波長紫外線中，只有短波紫外線UVC具有殺菌消毒作用，具有廣譜高效、不存在抗藥性、無二次污染等優(yōu)點。然而紫外線的穿透力較差，塵粒、濕度和有機物的含量等均會對其穿透性造成影響。空氣中含塵粒多，殺菌效能就會降低；相對濕度增高，殺菌效能也會降低。同樣，紫外線在液體中的穿透力，可隨著液體深度的增加而降低，水中雜質如溶解的鹽類、糖類與各種有機物均可降低紫外線的穿透力，阻擋紫外線的透過，從而影響其殺菌作用。乙醇作為常見的中效消毒劑具有成本低、適合表面消毒、對金屬材料腐蝕性低、無二次污染等優(yōu)點。然而乙醇對常見病原菌的殺滅效果非常有限[9]，僅靠乙醇難以實現(xiàn)對生產(chǎn)設備表面及環(huán)境有效消毒。NaOH作為強效消毒劑，在乳粉加工廠中也經(jīng)常使用。然而由于其對金屬材料有很強腐蝕性[13]，限制了其應用范圍。Jo等人[10]分別采用體積分數(shù)為70%乙醇或2,160 mW·s/cm2的UV連續(xù)處理后，均不再檢測出阪崎克洛諾菌，同時并沒有觀察到其具有協(xié)同殺菌的效果。然而，由于其采用0.1%蛋白胨水作為菌懸液，并不能真實地反映實際消毒程序的效果。Jo等人分別采用30%,40%和50%乙醇使阪崎克洛諾菌分別下降約1.73,3.02和4.17 mL-1（對數(shù)值），去除率高于本文的試驗結果。其原因可能就在于嬰幼兒配方奶有機物質量分數(shù)高于0.1%蛋白胨水，減弱了其消毒效果。乙醇和紫外線聯(lián)合使用對阪崎克洛諾菌產(chǎn)生了更好的消毒效果。推測原因可能是由于乙醇使克洛諾菌細胞壁受到破壞，同時紫外線的照射促使克洛諾菌的DNA嘧啶形成一個雙鍵，從而進一步抑制細胞生長。

阪崎腸桿菌在乳粉加工設施中可能的污染途徑和來源是目前研究的熱點。對重組嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)包括配料，均質，殺菌處理，噴霧干燥和包裝等過程。人們普遍認為Cronobacter的污染屬于在巴氏殺菌處理后的二次污染，包括干燥和包裝等過程。Mullane等人在乳粉加工廠的所有空氣過濾器中均分離發(fā)現(xiàn)克洛諾菌屬。Craven等人的研究表明，克洛諾菌屬廣泛分布在乳粉生產(chǎn)區(qū)和非生產(chǎn)區(qū)[14]。5家工廠中2%的環(huán)境樣品中分離出克洛諾菌屬，更多的克洛諾菌屬分離在非加工區(qū)（49%），高于加工區(qū)（29%）。經(jīng)過脈沖場凝膠電泳分析，129株克洛諾菌屬劃分為49組。7株在乳粉和同一個工廠的非加工區(qū)環(huán)境均分離到，包括蒸發(fā)室，員工的鞋和外部屋頂。Hein等人[5]對奶粉加工生產(chǎn)線進行采樣，在6個不同的采樣點均分離出新生兒病原體克洛諾菌屬。這些研究都表明克洛諾菌屬的污染主要來自于外部環(huán)境中，乳粉生產(chǎn)過程中防止克洛諾菌屬污染存在三個關鍵性控制點，即：控制頻繁的人流物流的污染，送風空氣的處理和消毒程序的強化。

Fu等人[15]的研究進一步證實了克洛諾菌屬的二次污染發(fā)生在干燥和灌裝階段這一假說，并強調了對設備表面的適當清洗的重要性。該研究模擬嬰兒配方奶粉生產(chǎn)過程等幾種亞致死實驗。接種克洛諾菌屬在三個潛在污染的切入點，包括加入添加劑，噴霧干燥和灌裝。結果表明，在巴氏消毒后，沒有克洛諾菌屬的檢出。然而，在噴霧干燥過程后，發(fā)現(xiàn)了克洛諾菌屬。乳粉生產(chǎn)設備中在長期運行過程中，材料表面會產(chǎn)生微小的裂隙，存在某些死角。生產(chǎn)設備中殘存的牛奶會為克洛諾菌屬提供良好的培養(yǎng)基，使其迅速生長，帶來嚴重的食品安全隱患。因此阻止克洛諾菌生物膜的形成對于杜絕該病原菌的污染十分關鍵。

Hein和Fu等人[5,15]在對加熱后的在線清洗系統(tǒng)（CIP）和模擬在線清洗后的不銹鋼材料進行檢測，研究也表明經(jīng)過標準化的在線清洗后，克洛諾菌屬仍可檢出，表明這些在線清洗的衛(wèi)生措施無法徹底消除加工生產(chǎn)線中的克洛諾菌屬。因此，本文建議在乳粉加工廠的貯存粉倉、噴霧干燥室和包裝室安裝紫外燈，并在消毒程序中采用，以便強化對材料表面和空氣的消毒處理，防止克洛諾菌屬生物膜的形成。每一批次生產(chǎn)結束后，對生產(chǎn)設備材料表面采取紫外線-乙醇聯(lián)合處理，將有助于減少這些病原體的傳播。

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Synergistic effects of ethanol and UV radiation to reduce levels of Cronobacter

FU Song-zhe1，GAO Jian-xin1，CHEN Hai-ying1，ZHANG Yue1，LIU Ying2，NI Xian-sheng1
（1.Nanchang Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330038,China；2.Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China）

To investigate whether combined treatments would produce synergistic disinfection effects on food products during food processing compared with single treatments,Cronobacter sakazakii cells in suspensions and biofilms formed on polycarbonate in diluted reconstituted powdered infant milk formula were treated with ethanol,NaOH and UV light as antibacterial treatments.The bactericidal effects of a commercial chemical disinfectant（ethanol）and of UV radiation on C.sakazakii NC830 in vitro were investigated.Treatment with 25%and 50%ethanol cause a decrease in the level of 3.65 and 4.05 log CFU per ml,but treatment with 75%ethanol reduced the levels to approximately 5.46 log CFU per ml,respectively.Various exposure doses of UV radiation with a UV lamp,reduced the levels to approximately 1.14,2.03 and 2.89 log CFU per ml.The synergistic effect of ethanol or UV treatment alone values for C.sakazakii were 2.81,3.85 and 5.07 log CFU/ml,respectively.A synergistic effect of combining ethanol and UV treatments against foodborne pathogens in vitro was observed.

Cronobacter；Powder Infant Formula（PIF）；UV；synergistic effects

Q93-33

A

1001-2230（2011）09-0017-04

2011-06-20

傅松哲（1985-），男，碩士，主要從事食品微生物學研究。