王今越,丁樹(shù)哲,王小虹,陳民盛,楊海東

p38、NF-κB、IL-6在長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠骨骼肌發(fā)生中的作用

王今越1,丁樹(shù)哲2,王小虹3,陳民盛4,楊海東5

目的:研究p38、NF-κB、IL-6在長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肌肉發(fā)生過(guò)程中的作用。方法:18只雄性SD大鼠分為3組,C組(安靜組)、E組(2周運(yùn)動(dòng)組)、I組(2周運(yùn)動(dòng)并施加NF-κB阻斷劑 PDTC)。檢測(cè) C、E組大鼠腓腸肌的質(zhì)量、p38、Phospho-p38、p65、Phosphop65、IL-6 mRNA、MRFs mRNA、MEF2c mRNA,I組檢測(cè)腓腸肌的質(zhì)量、IL-6 mRNA、MRFs mRNA、MEF2c mRNA。結(jié)果:與 C組相比,E組大鼠腓腸肌的質(zhì)量、Phospho-p38、Phosphop65、MyoD mRNA、MyoGmRNA、Myf-5 mRNA、MEF2c mRNA 上升 ,但 p38、p65、IL-6 mRNA、MRF4 mRNA未變;與 E組相比,I組大鼠腓腸肌質(zhì)量、MyoD mRNA、MyoGmRNA、Myf-5 mRNA、MEF2c mRNA 降低 ,但 IL-6 mRNA、MRF4 mRNA 未改變。結(jié)論:p38/NF-κB/MyoD、MyoG、Myf-5、MEF2c介導(dǎo)了長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉發(fā)生過(guò)程,但 IL-6可能沒(méi)有參與其中。

長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng);p38;NF-κB;IL-6;肌肉發(fā)生;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

前言

骨骼肌具有高度可塑性,長(zhǎng)期的肌肉收縮、特別是大強(qiáng)度的肌肉收縮會(huì)有效引起肌肉代償性生長(zhǎng),促進(jìn)肌肉圍度、肌肉質(zhì)量的增長(zhǎng),改善肌肉運(yùn)動(dòng)能力。肌肉生長(zhǎng)的核心機(jī)制是肌肉發(fā)生。狹義的肌肉發(fā)生僅指在胚胎發(fā)育過(guò)程中,體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列增殖、遷移、分化,最終形成肌肉組織的過(guò)程,廣義的肌肉發(fā)生還包括成體肌肉發(fā)育過(guò)程,它既包括成體肌肉干細(xì)胞的增殖、分化、融合、成熟,也包括肌纖維本身蛋白表達(dá)、合成的增強(qiáng)。多年來(lái),生物界、醫(yī)學(xué)界、體育界共同對(duì)成體肌肉發(fā)生機(jī)理展開(kāi)了大量的研究,并取得累累碩果,但是其細(xì)胞內(nèi)事件仍有很多未知問(wèn)題。

在肌肉發(fā)生諸多調(diào)控因子中,p38、NF-κB、IL-6的作用尤為引人注目。p38是肌肉發(fā)生特別是分化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)劑,阻斷p38α、β后明顯阻止了成肌細(xì)胞融入肌管及肌肉特異性基因的表達(dá),通過(guò)激活MKK6的突變體,激活p38在抑制因子存在的情況下,仍會(huì)誘導(dǎo)分化標(biāo)志物的表達(dá)和多核肌管的形成[11,22,36,39];NF-κB(僅指p50:p65復(fù)合體,下同)是被稱(chēng)作細(xì)胞生死開(kāi)關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,它的激活對(duì)肌肉發(fā)生和肌肉降解都有作用[32];IL-6-/-小鼠衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和肌核的增加均被抑制,肌肉發(fā)育明顯遲緩[30]。近年來(lái),C2C12細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),激活p38會(huì)誘導(dǎo) NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和 IL-6的上調(diào),并且α-actin mRNA與MCK依賴(lài)性熒光酶活性也顯著上升,應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑BAY11-7085降低 IL-6、α-actin mRNA及MCK依賴(lài)性熒光酶活性的水平 ,這提示 ,p38、NF-κB、IL-6三者構(gòu)成肌肉發(fā)生通路[21]。目前,該通路已經(jīng)引起關(guān)注,但活體研究中尚未見(jiàn)其相關(guān)報(bào)道[6]。p38、NF-κB、IL-6三者均對(duì)肌肉收縮敏感,長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)p38、NF-κB、IL-6的影響研究仍不多見(jiàn) ,特別尚無(wú)專(zhuān)門(mén)研究涉及活體運(yùn)動(dòng)中三者的關(guān)系,本研究推測(cè),p38/NF-κB/IL-6這條通路可能參與了長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉發(fā)生過(guò)程。

在肌肉發(fā)生過(guò)程中,成肌因子 MRFs(MyoD、MyoG、MRF4、Myf-5),起著核心作用,它們?cè)诔杉≥o助因子MEF2(主要是MEF2c)協(xié)同下啟動(dòng)肌肉特異性基因的表達(dá)。多數(shù)肌肉發(fā)生通路發(fā)揮作用需經(jīng) MRFs及 MEF2介導(dǎo)。目前,MRFs的研究多見(jiàn)于病理學(xué)研究,且多僅涉及MyoD、MyoG,運(yùn)動(dòng),特別是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì) MRFs的影響及其作用的研究仍不多見(jiàn),MEF2的研究更是少見(jiàn)。

本研究采用2周大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)為介導(dǎo),結(jié)合阻斷劑,以MRFs與MEF2c及肌肉質(zhì)量為肌肉發(fā)生的分子指標(biāo)和生理指標(biāo),檢驗(yàn)p38、NF-κB、IL-6三者在肌肉發(fā)生中的作用及它們之間的信號(hào)聯(lián)系。本研究擬采用p38、NF-κB、IL-6逐級(jí)截?cái)嗟姆绞綑z驗(yàn)三者聯(lián)系和對(duì)肌肉發(fā)生作用,但由于實(shí)驗(yàn)條件所限,IL-6-/-轉(zhuǎn)基因鼠難于獲得和p38特異阻斷劑 SB 203580非常昂貴,因此,本研究?jī)H阻斷 NF-κB,并據(jù)此展開(kāi)討論。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)方案

18只清潔級(jí)雄性9周齡、體重 240～280 g SD大鼠按體重分層后分為3組(盡量讓各組體重波動(dòng)范圍相近)。自由進(jìn)食,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度23℃,濕度40%～60%,自然晝夜節(jié)律變化光照。C組直接執(zhí)行表1方案,E、I組在正式運(yùn)動(dòng)前5天,進(jìn)行3天適應(yīng)性訓(xùn)練,休息2天后,執(zhí)行表1方案。

1.2 取材

E、I組大鼠最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h與C組一塊以斷頸椎方式處死,取腓腸肌,用4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗,去除血污,濾紙吸干水分,稱(chēng)重后切分成數(shù)段,錫箔紙包裹,做好標(biāo)簽,浸入液氮30 min后放入-80℃超低溫冰箱冷凍待測(cè)。

表1 動(dòng)物分組方案一覽表Table 1 Animal Group

1.3 主要試劑及試劑盒

p38 MAPK多克隆抗體(小鼠來(lái)源,43 KD):Santa Cruz;Phospho-p38 MAPK多克隆抗體(Thr 180/Tyr 182、小鼠來(lái)源,43 KD):Santa Cruz;tubulin多克隆抗體(小鼠來(lái)源,50 KD):Cell Signal;Trizol總RNA提取試劑 :Tiangen;Biort RT-PCR assasy kit:博日生物公司 ;NF-κB assay kit:KCTM生物公司。

1.4 方法

1.4.1 Phospho-p38(Thr180/Tyr182)、p38

提取骨骼肌蛋白,BCA法定量。western blotting測(cè)定P-p38(Thr180/Tyr 182)和p38。一般步驟略。關(guān)鍵步驟條件:聚丙烯酰胺凝膠濃度10%;20 V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)移1.5 h;一抗 P-p38、p38為 1∶800、tubulin為 1∶1000;稀釋 ,二抗為1∶1000。P-p38、p38蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值,以?xún)?nèi)參tubulin校正。

1.4.2 Phospho-p65(Ser237)、p65

嚴(yán)格按照 NF-κB elisa assay kit說(shuō)明書(shū)測(cè)試 P-p65(Ser237)及p65水平(該kit通過(guò)目的/內(nèi)參 GAPDH的OD比值對(duì)指標(biāo)半定量)。

1.4.3 IL-6、MRFs、MEF2c mRNA

按照 Trizol Reagent液說(shuō)明書(shū)提取總 RNA,總 RNA的質(zhì)量和純度檢測(cè)采用變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光檢測(cè)OD260/OD280比值,依據(jù)質(zhì)量和純度選取符合 RTPCR要求的 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照Biort RT-PCR kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄,總 RNA經(jīng) RT反應(yīng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用25μl體系。PCR循環(huán)條件:1)95℃5 min;2)95℃30 s;3)(IL-6:58℃;MyoD:60℃;MyoG:62℃;Myf-5:60℃;MRF4:60℃;MEF2c:62℃)40 s;4)72℃1 min;5)go to 2,25 cycles;6)72℃10 min;7)4℃forever。PCR產(chǎn)物加樣于 2%瓊脂糖凝膠、電泳(上樣量 12 μl,6×DNA loading buffer 2μl,電壓 150 V,電泳 35 min)。mRNA含量為條帶的OD值,以β-actin內(nèi)參校正。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±S),t檢驗(yàn)分析組間差異顯著性,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為0.05。WB、PCR、ELISA結(jié)果均標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表2 PCR引物一覽表Table 2 PCR Primer Sequences and Amplicon Size

2 結(jié)果

2.1 體重、腓腸肌質(zhì)量

圖1 運(yùn)動(dòng)、NF-κB阻斷對(duì)大鼠體重的影響直方圖Figure 1. Effects of Trainning of NF-κB Inhibitor on Rats’Body Wet Weight

圖2 運(yùn)動(dòng)、NF-κB阻斷對(duì)大鼠腓腸肌質(zhì)量的影響直方圖Figure 2. Effects of Trainning of NF-κB Inhibitor on Wet Weight of Rats’Gastrocnemiuses

2.2 P-p38、p38、P-p65、p65

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)Phospho-p38、p38的影響直方圖Figure 3. Effects of Trainning on Phospho-p38、p38

圖4 運(yùn)動(dòng)對(duì)Phospho-p65、p65的影響直方圖Figure 4. Effects of Trainning on Phospho-p65、p65

2.3 IL-6、MEF2c 、MRFs mRNA

圖5 運(yùn)動(dòng)、NF-κB阻斷對(duì)IL-6 mRNA影響直方圖Figure 5. Effects of Trainning of NF-κB Inhilbtor on IL-6 mRNA

圖6 運(yùn)動(dòng)、NF-κB阻斷對(duì)MEF2c mRNA影響直方圖Figure 6. Effects of Trainning and NF-κB Inhibitor on MEF2c mRNA

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)或NF-κB阻斷對(duì)體重、腓腸肌質(zhì)量的影響

本研究顯示,C、E、I組大鼠體重?zé)o顯著性差異,但 E、I組大鼠腓腸肌質(zhì)量均高于C組,且 E組高于 I組。從能耗而言,運(yùn)動(dòng)大鼠體重應(yīng)該較低,本研究運(yùn)動(dòng)沒(méi)有改變體重應(yīng)與運(yùn)動(dòng)后動(dòng)物饑餓感加劇,攝食量自然增大有關(guān)。各組體重相同,而運(yùn)動(dòng)鼠腓腸肌質(zhì)量增長(zhǎng),這說(shuō)明腓腸肌變化不是體重變化引起的,而是機(jī)械收縮誘發(fā)局部肌肉明顯發(fā)育所致,證明本運(yùn)動(dòng)模型符合肌肉發(fā)生的研究要求。I組腓腸肌質(zhì)量低于 E組,表明NF-ΚB阻滯了肌肉發(fā)生(NFΚB作用在下文進(jìn)一步討論)。

圖7 運(yùn)動(dòng)、NF-κB阻斷對(duì)MRFs mRNA影響直方圖Figure 7. Effects of Trainning and NF-κB Inhibitor on MRFs mRNA

3.2 運(yùn)動(dòng)或 NF-κB 阻斷對(duì) P-p38、p38、P-p65、p65、IL-6 mRNA的影響

本研究顯示,與 C組相比,E組 Phospho-p38(P-p38)顯著性升高,但該組p38含量不變。P-p38是p38激活的標(biāo)志。以往急性運(yùn)動(dòng)研究顯示,運(yùn)動(dòng)后即刻或運(yùn)動(dòng)后較短時(shí)間內(nèi),p38一過(guò)性激活,通常24 h內(nèi)完全恢復(fù)到正常水平[14,34],本研究中,P-p38在訓(xùn)練后48 h仍高于安靜組,這說(shuō)明,長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)條件下,p38活性上調(diào)更為穩(wěn)定,本研究與曹師承等(2007)[2]報(bào)道一致,該研究報(bào)道,大鼠7周游泳訓(xùn)練(1 h或 1.5 h/次/d、5次/周)后 48 h腓腸肌 P-p38仍然高于運(yùn)動(dòng)前。急性運(yùn)動(dòng)一般不影響p38總量[35,38],而長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)p38含量影響報(bào)道有差異,Ginneken(2006)[34]報(bào)道,4周游泳運(yùn)動(dòng)未影響大鼠肌肉p38含量,曹師承等(2007)[2]報(bào)道,兩組大鼠分別以1h/次/d或1.5h/次/d游泳訓(xùn)練了7周,1.5h組大鼠腓腸肌p38下調(diào),而1h組沒(méi)有改變,該研究認(rèn)為,p38下降可能是1.5h組的訓(xùn)練量過(guò)大造成了p38的分解。筆者贊同曹師承等(2007)[2]的觀點(diǎn),認(rèn)為本研究 E組p38總量未變,可能正說(shuō)明大鼠對(duì)于本運(yùn)動(dòng)方案可以較好適應(yīng),屬于適宜訓(xùn)練范圍,故而沒(méi)有造成p38顯著的分解加速。本研究p38與 P-p38變化的差異提示,運(yùn)動(dòng)對(duì)p38的激活與p38總體水平變化無(wú)關(guān)。

運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌質(zhì)量增加伴隨著p38激活提示,p38可能參與了運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉發(fā)生,這與本研究假設(shè)相符。細(xì)胞研究顯示,p38促進(jìn)肌肉發(fā)生可能主要通過(guò)三個(gè)途徑:1)調(diào)節(jié)組蛋白重塑。p38能夠磷酸化 E47(Ser140),繼而促進(jìn)E47-MyoD二聚體的形成,該二聚體能夠靶向組蛋白重塑酶SWI/SNF及RNA聚合酶到肌肉特異性基因座,激活肌肉特異性基因轉(zhuǎn)錄[23];2)調(diào)控肌肉分化mRNA的更替速度[12]。成肌細(xì)胞中,p38能夠磷酸化AU復(fù)函元件結(jié)合蛋白 KSRP,提高某些負(fù)責(zé)肌肉分化基因mRNA的穩(wěn)定性[8,23];3)調(diào)節(jié) MRFs及 MEF2活性或含量。p38可以直接磷酸化并增強(qiáng)MEF2a、2c的轉(zhuǎn)錄活性,也能促進(jìn)Myf-5、MyoG等成肌因子及 MEF2的表達(dá),但途徑未知[8]。本研究假設(shè),p38調(diào)控 MRFs、MEF2表達(dá)、調(diào)控肌肉發(fā)生是由 NF-κB、IL-6 介導(dǎo)的。

p38與NF-ΚB擁有很多共同的激活劑,如炎癥因子、佛波酯、細(xì)菌、紫外線等。近年來(lái),離體研究顯示,p38激活能夠加強(qiáng) NF-κB的某些靶基因的表達(dá),如 IL-6、IL-2、INOS、E-selectin等 ,p38抑制能夠降低 NF-κB 活性[6,26]。這些研究結(jié)論提示,至少在某些情況下,p38是 NF-κB的上游。p38對(duì)p65的調(diào)控可能主要通過(guò)兩條途徑:1)誘導(dǎo)IκBa(NF-κB抑制劑)從NF-κB分離,允許NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合。2)通過(guò)CBP/P300間接的誘導(dǎo)p65的轉(zhuǎn)激活[6]。功能上,與p38促進(jìn)肌肉發(fā)生不同,NF-κB被稱(chēng)為生死開(kāi)關(guān),它的激活固然通常與組織炎癥或損傷相聯(lián)系,但是,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生、紅細(xì)胞發(fā)生、肌細(xì)胞發(fā)生也都受它影響[25,28]。不同組織中,不同條件,NF-κB的作用都可能不同。有動(dòng)物肝、腎研究顯示,衰老引起 NF-κB活性上調(diào),而長(zhǎng)期規(guī)律運(yùn)動(dòng)能夠逆轉(zhuǎn)該趨勢(shì),其原因被認(rèn)為是衰老組織的自由基及其脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累、抗氧化劑含量和功能降低使得 ROS增高,繼而激活 NF-κB,NF-κB核轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的表達(dá),引起了DNA突變、蛋白質(zhì)變性,加速了細(xì)胞損傷、壞死或凋亡,而規(guī)律性的運(yùn)動(dòng)緩解了自由基的積累,改善了抗氧化劑功能,ROS水平降低,因此NF-κB活性下降[1,29]。在骨骼肌,NF-κB的變化和功能情況有所不同,Song(2006)[32]報(bào)道,衰老會(huì)降低大鼠腓腸肌質(zhì)量、NF-κB活性和Bcl2/Bax比值,而規(guī)律的運(yùn)動(dòng)(12周跑臺(tái))緩解、逆轉(zhuǎn)了上述指標(biāo)變化趨勢(shì),該研究提示,骨骼肌中NF-κB的激活可通過(guò)某些途徑,如抗凋亡基因Bcl2的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞的存活。為何不同組織中,NF-κB的變化和作用均有不同?Spangenburg(2006)[33]認(rèn)為,肝、腎是有絲分裂組織,而骨骼肌是有絲分裂后組織,在有絲分裂組織中,細(xì)胞處于不斷增殖、分化的活躍狀態(tài),NF-κB的職責(zé)主要是促進(jìn)細(xì)胞的死亡,讓細(xì)胞盡快更替,保證組織不過(guò)度發(fā)育,避免癌變,而衰老使得 NF-κB的活性不受控制的過(guò)分升高,造成細(xì)胞死傷過(guò)快,運(yùn)動(dòng)提高了對(duì) NF-κB的控制能力,終末分化組織中(如骨骼肌),其本身能夠用于補(bǔ)充、更新的干細(xì)胞庫(kù)較小,而且轉(zhuǎn)化效率也相對(duì)低下,因此,細(xì)胞自身要有較高存活能力來(lái)維護(hù)組織的完整性,否則組織很快會(huì)萎縮,因此,這類(lèi)細(xì)胞 NF-κB激活的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞生存和發(fā)育,衰老使得 NF-κB活性降低,細(xì)胞促生存、發(fā)育的能力受損,而運(yùn)動(dòng)會(huì)緩解、逆轉(zhuǎn)NF-κB下降趨勢(shì)來(lái)盡量保持組織的完整性。

本研究顯示,E組大鼠 Phospho-p65(P-p65)上調(diào)、p65不變。NF-κB與p38有所不同,作為轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB的活性通常指NF-κB DNA結(jié)合活性,但 EMSA測(cè)試條件及成本要求較高,已知 NF-κB的激活伴隨p65的磷酸化,因此也有不少研究以 P-p65來(lái)標(biāo)志 NF-κB的活性。盡管兩種指標(biāo)變化并不完全一致,但整體趨勢(shì)近似[7,9,15]。結(jié)果提示,長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)提高 NF-κB的活性,但其活性變化并非由p65含量改變所致,這一點(diǎn)與p38情況相同。本研究中,NF-κB激活伴隨肌肉質(zhì)量的增長(zhǎng)(E組大鼠腓腸肌質(zhì)量上升),NF-κB阻斷引起肌肉質(zhì)量下降(I組腓腸肌質(zhì)量小于E組)明確表明,NF-κB激活在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)下的作用是促進(jìn)肌肉組織存活和生長(zhǎng)的?？梢?jiàn),盡管研究角度不同(促肌肉發(fā)生VS降低細(xì)胞凋亡),但本研究在 NF-κB的促進(jìn)肌肉組織生存、維持方面作用的認(rèn)識(shí)與上述 Song(2006)[32]研究一致。然而,無(wú)可置疑的是,NF-κB激活是肌肉萎縮類(lèi)疾病共同特征,并且也有一些運(yùn)動(dòng)研究顯示,運(yùn)動(dòng)激活肌肉中NF-κB繼而引起炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),加重肌肉損傷、引起肌肉降解、質(zhì)量流失[17,18,20],這與我們提出的NF-κB促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)、發(fā)育的作用似乎矛盾,但需要指出,這些運(yùn)動(dòng)研究采用的多是對(duì)肌肉組織損傷較大的離心運(yùn)動(dòng)模型[9,10],而眾所周知的是,急性損傷與萎縮類(lèi)疾病的肌肉組織處于炎癥狀態(tài),本研究則不同,采用的是肌肉傷害較少、不會(huì)引起明顯炎癥反應(yīng)的上坡跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(向心運(yùn)動(dòng)為主),結(jié)果的差異提示,不同條件下,骨骼肌中NF-κB處于不同的信號(hào)通路中,向心運(yùn)動(dòng)中NF-κB承繼生長(zhǎng)信號(hào)(如p38等),并選擇性啟動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、維持的基因的轉(zhuǎn)錄,病理狀態(tài) NF-κB則承繼的是炎癥信號(hào)(如TNFα等),選擇性啟動(dòng)促炎癥、促凋亡的基因的轉(zhuǎn)錄,該問(wèn)題有待進(jìn)一步證實(shí),如果確實(shí)如此,則 NF-κB靶基因的選擇調(diào)節(jié)機(jī)制也是個(gè)重要問(wèn)題。當(dāng)然,p38、NF-κB在活體的關(guān)系研究仍需要通過(guò)p38激動(dòng)劑或抑制劑來(lái)驗(yàn)證。

分子生物學(xué)研究已經(jīng)確認(rèn),NF-κB本身并不能直接調(diào)控肌肉特異性蛋白或 MRFs表達(dá),因此,它對(duì)肌肉生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)應(yīng)該存在其他分子的介導(dǎo),NF-κB的靶基因IL-6可能是介導(dǎo)分子之一。IL-6是一種組織中普遍存在的糖基化蛋白,安靜時(shí)骨骼肌 IL-6含量很低,運(yùn)動(dòng)時(shí),骨骼肌 IL-6迅速生成并釋放入血,成為循環(huán)血IL-6的最大來(lái)源[4]。功能上,IL-6最初被認(rèn)為是與IL-1等作用類(lèi)似的炎癥因子,但是近來(lái)已經(jīng)證明,IL-6與炎癥關(guān)聯(lián)并不密切[5]。IL-6對(duì)多種細(xì)胞發(fā)生有影響,它可促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖、B細(xì)胞的分化與成熟、T細(xì)胞的增殖與分化、肝細(xì)胞分化、神經(jīng)細(xì)胞的分化、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生,肌肉發(fā)生中,它的作用也很重要,IL-6-/-小鼠肌肉發(fā)育遲緩[30],施加 IL-6的小鼠成肌細(xì)胞C2C12的α-actin mRNA、MCK依賴(lài)性熒光酶活性明顯上調(diào)[6],但是它調(diào)控肌肉發(fā)生的機(jī)制仍不得而知,筆者推測(cè)可能與MRFs、MEF2有關(guān)。

與p38或 NF-κB相比,IL-6對(duì)肌肉收縮刺激更為敏感,有報(bào)道,高強(qiáng)度急性運(yùn)動(dòng)后,大鼠肌肉中 IL-6 mRNA上調(diào)100倍[27],長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì) IL-6報(bào)道極少,僅見(jiàn) Fischer(2004)[13]曾報(bào)道“10周耐力訓(xùn)練沒(méi)有改變?nèi)梭w骨骼肌 IL-6 mRNA水平”,本研究與此結(jié)果一致,即 E組、I組的 IL-6 mRNA水平均未改變,這說(shuō)明長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)與NF-κB阻斷都未影響IL-6的基因表達(dá),顯然,該結(jié)果與我們最初假設(shè)相悖,提示,IL-6未參與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的肌肉發(fā)生過(guò)程,也不是p38/NF-κB的信號(hào)的下游。當(dāng)然,IL-6 mRNA與 IL-6的動(dòng)力學(xué)關(guān)系可能不完全一致,且本研究結(jié)果也不能代表所有運(yùn)動(dòng)類(lèi)型,因而此結(jié)論仍需要謹(jǐn)慎對(duì)待。

3.3 運(yùn)動(dòng)或 NF-κB阻斷對(duì) MEF2c、MRFs mRNA的影響

MRFs是肌肉發(fā)生的核心調(diào)控因子,有 MyoD、MyoG、Myf-5、MRF4四個(gè)成員。它們?cè)?MEF2(主要是 MEF2c)和 E蛋白協(xié)同下激活肌肉特異性基因(如α-actin、煙堿乙酰膽堿受體、β-原肌球蛋白、MHC、結(jié)蛋白、肌鈣蛋白 C、CK、MCK等)轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)和更替。MRFs總體水平低下是多種慢性肌肉萎縮類(lèi)癥狀的共同特征,肌肉肥大也通常伴隨某些MRFs的上調(diào)[16]。MRFs表達(dá)具有一定時(shí)空特征,時(shí)間上,Myf-5、MyoD在衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖生成成肌細(xì)胞過(guò)程中開(kāi)始上調(diào),而MRF4與MyoG在成肌細(xì)胞分化為肌管期開(kāi)始上調(diào),分布上,MyoD高表達(dá)于快肌,MyoG高表達(dá)于慢肌。功能上,MRFs成員各自特點(diǎn)和差異目前并未完全研究透徹,特別是相對(duì)于 MyoD、MyoG而言,人們對(duì) Myf-5、MRF4特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)還不夠,很多研究提出,MyoD、Myf-5引導(dǎo)肌肉干細(xì)胞增殖,而 MRF4、MyoG則引導(dǎo)分化[24];也有一些意見(jiàn)認(rèn)為,MyoD與MRF4均參與肌肉干細(xì)胞的增殖與分化[16,37],此外,MyoD與MyoG被認(rèn)為是肌肉表型塑造的關(guān)鍵因子——MyoD促進(jìn) MHC IIb、X及某些酵解酶基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)快肌發(fā)育,MyoG促進(jìn)MHC I、IIa和某些氧化酶基因轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)慢肌生長(zhǎng),二者變化分別與快、慢肌量變化一致,二者比例變化也被認(rèn)為是快慢肌相互轉(zhuǎn)化的有效指標(biāo)[3]。

本研究顯示,與C組相比,E組MRF4(不變)外的所有MRFs成員及 MEF2c mRNA均上調(diào)。顯然,不論上述對(duì)MRFs成員功能的哪種看法正確,本結(jié)果都可以說(shuō)明,長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)下,肌肉干細(xì)胞增殖和分化均處于活躍期。MRF4 mRNA沒(méi)有上調(diào)跡象可能是因?yàn)楣δ芘c它近似的MyoG上調(diào)已經(jīng)可以滿足細(xì)胞分化需求,此外,MRF4上調(diào)能夠加速 MyoD的分解[19],因此 MRF4的不變也能保證MyoD功能順利的發(fā)揮。MEF2c mRNA的上調(diào)與MRFs mRNA上調(diào)匹配,輔助 MRFs調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。MyoG、MyoD mRNA的共同上調(diào)提示快、慢肌均有所增長(zhǎng),此特征與本研究采用的運(yùn)動(dòng)方式一致,因?yàn)楸狙芯坎捎玫拈L(zhǎng)期大強(qiáng)度方案,確切來(lái)說(shuō)是長(zhǎng)期(2周)、長(zhǎng)時(shí)間(1 h/次)、大強(qiáng)度(27 m/min)的訓(xùn)練方式,大強(qiáng)度肌肉收縮主要刺激快肌發(fā)育,長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)主要發(fā)展慢肌,長(zhǎng)期訓(xùn)練作用一般是穩(wěn)定指標(biāo)變化趨勢(shì)。

進(jìn)一步對(duì)指標(biāo)變化幅度進(jìn)行觀察,可以發(fā)現(xiàn),E組MyoGmRNA上調(diào)幅度大于 MyoD,表明慢肌可能增長(zhǎng)較快,這意味著本訓(xùn)練模式導(dǎo)致肌肉類(lèi)型整體上發(fā)生快-慢的轉(zhuǎn)換(MyoD mRNA/MyoGmRNA降低)。與本研究不同,8周大強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練后,大鼠肌肉中MyoGmRNA和蛋白水平的升高伴隨著CS,COX II和COX VI mRNA的升高,但MyoD mRNA和蛋白水平均沒(méi)有變化[31]。筆者認(rèn)為,MyoD變化差異可能是所在訓(xùn)練不同階段所致,本研究采用2周訓(xùn)練,對(duì)于大鼠而言,這個(gè)時(shí)段可能處于訓(xùn)練初期的肌肉發(fā)育的快速增長(zhǎng)期,因此,MyoG和MyoD均上調(diào)來(lái)滿足快、慢肌生長(zhǎng)的需要。而8周訓(xùn)練使大鼠機(jī)體逐漸適應(yīng)了負(fù)荷后,無(wú)氧閾提高,無(wú)氧性質(zhì)刺激反應(yīng)降低,有氧刺激比例加大,因此,MyoD的上調(diào)及快肌生長(zhǎng)逐漸停滯,而MyoG仍然處于高水平,這符合長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練主要發(fā)展慢肌纖維工作能力的規(guī)律。

蘇艷紅(2007)[3]報(bào)道,大鼠低強(qiáng)度耐力訓(xùn)練28天后,后淺層脛前肌MyoD、MyoGmRNA均顯著下降。一般而言,這類(lèi)中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)利于動(dòng)物肌肉量的保持,起碼對(duì)于慢肌的生存、發(fā)育是有益的,因此至少M(fèi)yoGmRNA不應(yīng)下調(diào),筆者尚不能解釋此問(wèn)題,這有待進(jìn)一步調(diào)查,這也說(shuō)明,MRFs的控制非常復(fù)雜。

本研究發(fā)現(xiàn),NF-κB的阻斷對(duì) MRFs及 MEF2c mRNA表達(dá)均有作用,即與 E組相比,I組 MyoD、MyoG、Myf-5、MEF2c mRNA均降低。這些指標(biāo)降低與 I組肌肉增長(zhǎng)阻滯一致。本研究也發(fā)現(xiàn),MRF4 mRNA不變。結(jié)果提示,MyoD、MyoG、Myf-5、MEF2c基因表達(dá)可能是 NF-κB 依賴(lài)性的。由于NF-κB不能直接影響 MRFs或 MEF2基因表達(dá),下一步需要研究的是溝通 NF-κB與 MRFs、MEF2c的基因表達(dá)的中介分子為何。對(duì)MRFs變化幅度進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與 E組相比,I組 MyoGmRNA下降幅度高于MyoD,提示 I組大鼠肌肉發(fā)生程度的降低及慢-快肌的轉(zhuǎn)化(MyoD mRNA/MyoGmRNA升高),此特征與我們已知的“肌肉發(fā)育障礙、萎縮時(shí),慢肌將向快肌轉(zhuǎn)化,最大限度保證肌肉維持一定活動(dòng)能力”一致,也提示 NF-κB對(duì)MyoG影響可能大于MyoD。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,腓腸肌的質(zhì)量、p38活性、NF-κB活性、MyoD mRNA、MyoD mRNA、Myf-5 mRNA、MEF2c mRNA上升,且MyoD mRNA上升幅度小于 MyoG,而 IL-6 mRNA、MRF4 mRNA未變。NF-κB阻斷降低了腓腸肌的質(zhì)量、MyoD、MyoG、Myf-5、MEF2c mRNA,且 MyoD 下降幅度小于MyoG,而 IL-6 mRNA、MRF4 mRNA未受影響。本研究提示 ,p38/NF-κB/MyoD、MyoG、Myf-5、MEF2c介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的肌肉發(fā)生,但 IL-6可能沒(méi)有參與其中;長(zhǎng)期、長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度刺激下,快、慢肌均有增長(zhǎng),慢肌增長(zhǎng)幅度較大,肌肉總體類(lèi)型仍將發(fā)生快-慢的轉(zhuǎn)化;NF-κB阻斷后,快、慢肌生長(zhǎng)均受抑制,但慢肌受影響更大,肌肉類(lèi)型發(fā)生慢-快的轉(zhuǎn)化。

限于本研究的條件,一些問(wèn)題仍難于避免,筆者認(rèn)為有些問(wèn)題需要注意:1)活體中,特別是運(yùn)動(dòng)條件下,p38對(duì)NF-κB作用需要進(jìn)一步證實(shí);2)謹(jǐn)慎看待“IL-6不是p38/NF-κB/下游,及它沒(méi)有參與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肌肉發(fā)生的過(guò)程”的結(jié)論,未來(lái)研究需要確認(rèn)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì) IL-6水平的影響;3)調(diào)查 NF-κB如何調(diào)控 MRFs、MEF2c基因表達(dá);4)轉(zhuǎn)錄因子MRFs、MEF2c的mRNA或蛋白水平均非最佳衡量其功能最佳指標(biāo),未來(lái)應(yīng)該考慮檢測(cè)它們的DNA結(jié)合活性。

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Effect of p38,NF-κB,IL-6 on Long-term High Intensity Exercise Induced Myogenesis

WANGJin-yue1,DIN GShu-zhe2,WANGXiao-hong3,CHEN Min-sheng4,YANGHai-dong5

Objective:To explore the function of p38,NF-κB,IL-6 in exercise induced myogenesis.Methods:18 male SD rats were divided into 3 groups,C group(quiet group),E group(2 wk exercise),and I group(2 wk exercise with PDTC).Detect weight,p38,Phospho-p38,p65,Phospho-p65,IL-6 mRNA,MRFs mRNA,MEF2c mRNA of C and E group rats’gastrocnemiuses,and weight,IL-6 mRNA,MRFs mRNA,MEF2c mRNA of I group rats’gastrocnemiuses.Results:Compared with C group,gastrocnemius,weight,Phospho-p38,Phosphop65,MyoD mRNA,MyoGmRNA,Myf-5 mRNA,and MEF2c mRNA increased but p38,NF-κB,IL-6 mRNA,MRF4 mRNA unchanged in E group.Compared with E group,gastrocnemius weight,MyoD mRNA,Myo GmRNA,Myf-5 mRNA,MEF2c mRNA decreased but IL-6 mRNA and MRF4 mRNA unchanged in I group.Conclutions:p38/NF-κB/MyoD,MyoG,Myf-5,MEF2c may facilitate exercise-induced myogenesis but IL-6 doesn’t involve in.

Long-term high intensity exercise;p38;N F-κB;IL-6;Myogenesis

G804.7

A

1000-677X(2010)02-0075-08

2009-09-09;

2010-01-10

上海市2007年度浦江人才計(jì)劃(44038470);教育部2007年度新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(790013P8);吉林省2007年體育局課題(2007D11)。

王今越(1978-),男,滿族,吉林長(zhǎng)春人,講師,博士,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)適應(yīng)和機(jī)能評(píng)定,E-mail:wjytnt@tom.com。

1.佛山大學(xué)體育學(xué)院,廣東佛山528000;2.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院,上海 200062;3.東北師范大學(xué)體育學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130026;4.深圳大學(xué) 體育部,廣東深圳518060;5.東北大學(xué)體育部,遼寧沈陽(yáng)110819

1.Foshan University,Foshan 528000,China;2.East ChinaNormalUniversity,Shanghai200062,China;3.Northeast Normal University,Changchun 130026,China;4.Shenzhen University,Shenzhen 518060,China;5.Northeastern University,Shenyang 110819,China.