張志宇 ，張佳敏 ，王衛(wèi) ,*，付曉 ，郭秀蘭 ，李翔

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106）

胰酶酶解豬骨素的工藝條件

張志宇1，張佳敏2，王衛(wèi)2,*，付曉1，郭秀蘭2，李翔2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106）

利用胰酶酶解豬骨素并測定其酶解液的水解度。通過單因素試驗(yàn)確定胰酶水解豬骨素的酶解溫度、pH值、酶用量、料液比（底物濃度）及水解時間，在此基礎(chǔ)上用正交試驗(yàn)分析酶解的最佳工藝，在本試驗(yàn)條件下，酶解的最佳工藝為在溫度45℃，pH7.5，酶用量8750U/g以及料液比1∶12.5g/mL條件下酶解3h，此條件下水解度可以達(dá)到25.00%。

骨素；胰酶；酶解；工藝

我國的肉類總產(chǎn)量近6000萬t，約占世界肉類總產(chǎn)量的1/4[1]，每年因生產(chǎn)肉類而產(chǎn)出的畜禽骨近2000萬t。產(chǎn)出的畜禽骨一般被用于加工骨膠、骨油、骨粉等，或作為工業(yè)原料、動物飼料和肥料[2]，利用方式比較粗放，而且骨制產(chǎn)品的附加值很低[3]，不僅造成資源的浪費(fèi)，而且給環(huán)境保護(hù)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4-5]。

畜禽骨的開發(fā)利用起步較晚，20世紀(jì)80年代才在世界上受到重視。但是由于資金、技術(shù)以及消費(fèi)者對骨食品認(rèn)識的欠缺等因素，我國的骨食品開發(fā)處于比較落后的水平。提高畜禽骨的綜合利用率，加快畜禽骨加工制品的優(yōu)質(zhì)化，已成為提高我國農(nóng)牧業(yè)水平和農(nóng)產(chǎn)品加工效益、實(shí)現(xiàn)清潔化生產(chǎn)及可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。應(yīng)用現(xiàn)代酶解技術(shù)，將畜禽骨加工為高附加值產(chǎn)品，已是國內(nèi)外肉類行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

骨素提取加工是畜禽骨高效利用的重要途徑，其主要利用方式之一是制取天然調(diào)味料，畜禽骨經(jīng)清洗、蒸煮提取、濃縮等制得，其中蛋白酶對原料提取液進(jìn)行水解，得到有一定水解度的溶液，對提高原料中游離氨基酸的含量，增加美拉德反應(yīng)中生香前驅(qū)物質(zhì)量，強(qiáng)化產(chǎn)品的顯味能力具有重要作用。在用蛋白酶水解骨素時，酶解條件對產(chǎn)品的呈味作用很重要，因此骨素的酶解工藝得到廣泛關(guān)注，已有利用蛋白酶等對畜禽骨泥水解的研究報道[6]，但是對于較佳酶解工藝條件以及不同蛋白酶的比較研究仍然較少，為此本文研究了胰酶酶解豬骨骨素的工藝條件，為畜禽骨高效利用提供更充分的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

骨素由四川省樂山市天添食品有限公司提供（由豬骨經(jīng)蒸煮提取制得）；胰酶購于北京華瑞新成科技有限公司（酶活力250000 U/g）。

1.2 試驗(yàn)方法

先通過單因素試驗(yàn)確定胰酶水解豬骨素時最佳酶解溫度、pH值、酶用量、料液比（底物濃度）及水解時間，再采用正交試驗(yàn)分析，選擇各因素的參數(shù)范圍，用L9（34）正交表進(jìn)行酶解工藝條件的優(yōu)化。

1.2.1 酶解條件的確定

1）酶解溫度：通過預(yù)試驗(yàn)確定初步篩選條件，用料液比為（底物濃度）為1∶10的骨素溶液，并分別在溫度為 35、40、45、50、55 ℃，加酶量 5000 U/g，pH7 的條件下水解3 h，測定水解度并找出最適的酶解溫度。

2）料液比（底物濃度）：通過預(yù)試驗(yàn)確定初步篩選條件，根據(jù)最適的胰酶酶解溫度，分別在料液比（底物濃度）為 1∶2.5、1∶10、1∶7.5、1∶5（g/mL），加酶量為 5000U/g，pH值為7的條件下水解3 h，測定水解度并找出最佳酶解料液比。

3）酶解pH值：通過預(yù)試驗(yàn)確定初步篩選條件，根據(jù)最適胰酶酶解溫度和料液比（底物濃度），分別在pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加酶量 5000 U/g 的條件下水解3 h，測定水解度并找出最佳酶解pH。

4）加酶量：通過預(yù)試驗(yàn)確定初步篩選條件，根據(jù)最適胰酶酶解溫度，料液比（底物濃度）和pH值，并在加酶量分別為 2500、5000、7500、10000 U/g條件下酶解3 h，測定水解度并找出最佳酶解加酶量。

5）酶解時間：選擇以上的最佳酶解條件，并在1 h～6 h水解過程中每隔1h測定水解度并找出最佳酶解時間。

1.2.2 水解度（DH）的測定

樣品含氮量用凱氏定氮法測定[7]；水解后產(chǎn)生的游離氨基氮用甲醛滴定法測定[8]，測定總氮用凱氏定氮法測定。

式中：DH為蛋白質(zhì)水解度；N2為酶解后游離氨基氮含量；N1為酶解前游離氨基氮含量；N0為總氮含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解溫度的確定

用胰酶在選定溫度范圍對豬骨素進(jìn)行酶解，酶解后豬骨素的水解度（DH）結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，酶解溫度對水解度的影響較大，在溫度低于45℃時，隨著酶解溫度的升高水解速度及水解度增加；當(dāng)溫度超過45℃時，水解速率與水解度反而下降。由圖1中的溫度變化趨勢可知，胰酶水解豬骨素的最適溫度在45℃左右。

2.2 料液比的確定

料液比對反應(yīng)速率起著重要的作用。在選定的料液比對骨素酶解3 h，測定最終酶解液的水解度，結(jié)果如圖2。

如圖2所示，隨著料液比的增大，水解度不斷升高，但是料液比過高時水解度反而下降。結(jié)果表明，酶解骨素的最適料液比為 1∶10（g/mL）。

2.3 酶解pH值的確定

在選定的pH值范圍內(nèi)對豬骨素酶解3 h，測定在不同pH值下骨素的水解度，結(jié)果如圖3。

在pH值小于8時，骨素的水解度隨pH的增高而增加，但是在pH值為9時，水解度反而下降，在pH值為8時出現(xiàn)了水解度的峰值。因此，胰酶水解骨素的最適pH值在8左右。

2.4 加酶量的確定

在選定加酶量為 2500、5000、7500、10000 U/g時對豬骨素酶解3 h，測定在不同加酶量下豬骨素的水解度，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著加酶量的增加，骨素的水解度增加，但是當(dāng)加酶量增加到7500 U/g以上時，骨素的水解度變化趨于平緩，在加酶量為10000 U/g時水解度較2500 U/g時增長幅度為3.3%，加酶量為7500 U/g時水解度較2500 U/g時增長幅度為12.1%，加酶量為5000 U/g時水解度較2500 U/g時增長幅度為3.68%。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，本試驗(yàn)選用的加酶量為7500 U/g左右。料液比（底物濃度）確定的條件下，水解度的值隨著加酶量的增加而加大，但是加入的酶過多，成本增加的同時，酶也可能自溶。

2.5 酶解時間的確定

酶解1 h～6 h后測定胰酶酶解骨素的水解度，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，骨素的水解度不斷增加，在2 h～3 h之間，水解度增幅最大。試驗(yàn)中同時發(fā)現(xiàn)，酶解時間超過4 h，酶水解液略有苦味。綜合考慮以上因素確定胰酶酶解時間為3 h。

2.6 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)確定了各因素的取值范圍，進(jìn)而用L9（34）正交表對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

表1 胰酶L9（34）正交設(shè)計方案及試驗(yàn)結(jié)果Table1 The pancreatic enzyme of L9（34）orthogonal design and results

從表1中的R值可以看出，各因素對水解度影響的大小順序是：C＞A＞B＞D。由表1中的極差可知，最好的酶解工藝組合為C3A2B1D3，即pH值7.5，加酶量8750 U/g，溫度 45 ℃，料液比 1∶12.5（g/mL）時酶解效果最好，在此條件下的水解液水解度最高。

3 結(jié)論

對影響胰酶水解骨素的關(guān)鍵因素進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下胰酶水解骨素的最佳工藝條件為：pH7.5，加酶量8750 U/g，溫度45℃，料液比1∶12.5（g/mL），水解時間 3 h。在此條件下對骨素進(jìn)行水解試驗(yàn)的最終水解度為25.00%。酶解后最大限度地保持原有動物新鮮骨肉天然的味道和香氣，具有良好的風(fēng)味增強(qiáng)效果。經(jīng)酶解后新形成的動物水解蛋白，其用途相當(dāng)廣泛，如用于肉味香精的制造及應(yīng)用于肉制品中等。

[1]尚一平.骨的營養(yǎng)價值及在灌腸生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].肉類工業(yè),2007(1)：14-15，21

[2]趙霞，馬麗珍.酶解骨蛋白的研究[J].食品科技,2003(7)：99-101

[3]葉明泉，鄧國棟，韓愛軍，等.超細(xì)鮮骨粉的制備及其營養(yǎng)功能研究[J].南京理工大學(xué)學(xué)報,1999，23(1)：6-9

[4]楊迎伍，張利，李正國.畜骨的營養(yǎng)價值、開發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].食品科技，2002(1)：60-62

[5]夏秀芳.畜禽骨的綜合開發(fā)利用[J].肉類工業(yè)，2007(5)：22-25

[6]丁小燕，張雯，陳延峰，等.復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解雞骨泥工藝條件的研究[J].中國食品學(xué)報，2006(3)：88-92

[7]張水華.食品分析[M].中國輕工業(yè)出版社，2004：156-159

[8]陳鈞輝，陶力，李俊，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].科學(xué)出版社，2003：57-58

Enzymolysis Process of Pig Bone Extract by Pancreatic Enzyme

ZHANG Zhi-yu1，ZHANG Jia-min2，WANG Wei2,*，F(xiàn)U Xiao1，GUO Xiu-lan2，LI Xiang2
（1.Biological Engineering Institute，Xihua University，Chengdu 610039,Sichuan,China；2.Sichuan Province Key Laboratory of meat processing，Chengdu University,Chengdu 610106，Sichuan,China）

Pig bone was hydrolysis by pancreatic enzyme and measured the hydrolysis degree of hydrolyzate.Based on single factor（temperature,pH,amount of enzyme,rate of raw material and water,hydrolysis time）experiment,hydrolysis process of pig bone extract by pancreatic enzyme was investigated.Result of orthogonal experiment indicated that the optimal hydrolytic process for pig bone extract was temperature 45℃,pH 7.5,amount of enzyme 8750 U/g,rate of raw material and water 1∶12.5 g/mL,hydrolysis time 3 h and the degree of hydrolysis could reach to 25.00%.

pig bone extract；pancreatic enzyme；hydrolysis；technology

四川省科技廳基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目“微膠囊技術(shù)在預(yù)調(diào)現(xiàn)冷保鮮食品中的應(yīng)用研究”（2008JY0219-1）

張志宇（1983—），男（漢），在讀研究生，研究方向：食品加工與貯運(yùn)保鮮。

*通訊作者：王衛(wèi)，教授，成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，研究方向：食品加工與貯運(yùn)保鮮。

2009-08-11