高桂華，趙連爽

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽(yáng)110001）

Graves病（Graves’disease，GD）是一種器官特異性自身免疫病，即突眼性甲狀腺腫。80%患者體內(nèi)存在抗促甲狀腺激素刺激激素受體抗體（thyrotrophin receptor antibody，TRAb），最顯著的病理組織學(xué)特點(diǎn)是甲狀腺、眼睛等效應(yīng)器官內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，浸潤(rùn)細(xì)胞中存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞［1］，這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞與特異性損傷密切相關(guān)，并在Graves病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能夠抑制CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，從而抑制人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖［2］。Foxp3（forkhead/winged helix family transcriptional repressor）是最近發(fā)現(xiàn)的Tregs的特征性標(biāo)志［3］。本實(shí)驗(yàn)以胞內(nèi)染色技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)和分析Graves病患者外周血中Tregs的數(shù)量和免疫抑制功能變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

45例初發(fā)GD患者（GD組，男性13例，女性32例）均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診或住院部，所有患者均未經(jīng)治療，臨床表現(xiàn)為甲狀腺?gòu)浡阅[大，雙眼球突出，代謝亢進(jìn)，平均年齡40.5歲（27～55歲）。20例健康體檢者（對(duì)照組，男性5例，女性15例），平均年齡38歲（24～52歲），無(wú)自身免疫疾病及家族史。年齡、性別在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者及健康體檢者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

抗CD3-Percp、抗CD4-APCcy7、抗CD25-APC購(gòu)自BD bioscience，F(xiàn)oxp3-PE kit購(gòu)自ebioscience。流式細(xì)胞儀為BD FACSArial。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

EDTA抗凝管抽取5 ml外周靜脈全血，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），計(jì)數(shù)2×106個(gè)細(xì)胞，加入 CD3、CD4、CD25抗體各10 μl，4℃避光孵育25 min，洗滌2次，加入1ml Fix/permeabilizatioin，4℃避光孵育30 min，Perm Wash2ml洗滌1次，加入20 μl Foxp3抗體，4℃避光孵育25 min，Perm Wash2ml洗滌1次，加入150 μl多聚甲醛固定，上機(jī)分析，每個(gè)樣本獲取1×105個(gè)細(xì)胞，所有結(jié)果以占CD4+T細(xì)胞百分比表示。放射免疫分析法檢測(cè)TT3，TT4，TSH，檢測(cè)方法按照試劑及儀器說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺激素水平

GD組與健康對(duì)照組相比，TT3、TT4水平明顯高于健康對(duì)照組，TSH水平低于健康對(duì)照組。見(jiàn)表1。

2.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平

GD 組 CD4+CD25+T細(xì)胞［（4.9±1.6）%］水平明顯低于健康對(duì)照組［（8.9±2.9）%］（P<0.05），CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞［（3.2±1.7）%］水平明顯低于健康對(duì)照組［（6.5±3.6）%］（P<0.05），CD4+Foxp3+T 細(xì)胞［（4.6±2.2）%］水平也明顯低于健康對(duì)照組［（7.3±4.3）%］（P<0.05）。

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有調(diào)節(jié)功能的成熟T細(xì)胞亞群，因其具有抑制免疫反應(yīng)的作用，一直被稱(chēng)作抑制性T細(xì)胞。Treg的種類(lèi)較多，依據(jù)其發(fā)育、特異性及作用機(jī)制分為天然Treg與獲得性Treg，其中CD4+CD25+Treg是研究較為深入的天然Treg，Treg的特征性的分子標(biāo)志是Foxp3，它也是Treg不同于活化T細(xì)胞的重要特征。

研究顯示在自身免疫性疾病中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯下降［4～6］，對(duì)GD患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平的變化研究尚少，結(jié)果也不盡相同，黨珊等［7］發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg水平下降，而唐大海等［8］則認(rèn)為GD患者Treg水平無(wú)明顯變化，主要是Treg免疫抑制功能的降低。本研究結(jié)果顯示GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯低于健康成人，與黨珊［7］的結(jié)果相似，說(shuō)明在GD患者發(fā)病過(guò)程中，具有免疫抑制功能的Treg數(shù)量減少，可能在一定程度上對(duì)于自身反應(yīng)性T細(xì)胞抑制能力降低，在感染或情緒刺激作用下，自身反應(yīng)T細(xì)胞增殖，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生TSH受體抗體，導(dǎo)致GD的發(fā)生。

綜上，GD患者CD4+CD25+Foxp3+Treg水平明顯低于健康成人，提示在GD發(fā)病及發(fā)展中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能發(fā)揮重要作用，這對(duì)于闡明GD的機(jī)制可能具有很大意義。進(jìn)一步，在GD發(fā)病早期我們可以通過(guò)減慢或阻止Treg數(shù)量減少來(lái)延緩GD的發(fā)展，為治療GD提供了一種新的思路與可能。

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