王波，閻德民，李慶志，陶涼，朱楠

（1.武漢亞洲心臟病醫(yī)院 心臟外科，武漢 430022；2.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院心臟外科，沈陽110001；3.大慶油田總醫(yī)院 心胸外科，黑龍江 大慶163000；4.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院心內科，沈陽110001）

心臟外科手術及急性心肌梗死患者急診經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous transluminal coronary intervention，PCI）中，心肌保護是最關鍵的部分，而心肌缺血再灌注損傷逐漸成為研究的熱點，因為它可以抵消心臟手術、急診PCI給患者帶來的益處。如何預防及治療心肌再灌注損傷已成為心臟科醫(yī)師必須面對的問題。最近的研究表明“缺血后適應”可明顯減輕心肌再灌注損傷。Zhao等［1］首先提出經典后適應概念，即再灌注后立刻給予1次或多次短暫重復心肌缺血與再灌注，它能提高心肌對之前發(fā)生的較長時間缺血的耐受性。缺血后適應與缺血預適應相似，是機體對缺血性損傷的一種自然保護機制，二者有部分效應器及信號轉導途徑相似，如磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol3 kinase-protein kinase B，PI3k-Akt）途徑、細胞外信號轉導途徑，并且二者均可通過抑制線粒體膜滲透性轉換 孔 （mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放而保護心肌。本研究應用離體的大鼠心臟模型來驗證缺血后適應對缺血再灌注損傷的保護作用并探討其機制是否與Akt的激活有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2周齡健康SD大鼠30只，體質量250～300 g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.2 模型制作

（1）準備 Langendorff心臟灌注裝置，Krebs-Henseleit（K-H）液預先加入到Langendorff心臟灌注裝置的內管中；（2）所有大鼠均采用水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸前5 min腹腔注射肝素500 U/kg，快速正中開胸取出心臟浸于K-H液中，輕輕擠壓心臟排出心腔內的積血；（3）迅速懸掛心臟于Langendorff心臟灌注裝置上，K-H液以一定的壓力持續(xù)灌注；（4）由大鼠自身心臟結構決定凡心率＜200/min或冠脈流量小于8 ml/min的心臟以及表面出現(xiàn)梗死的心臟棄之不用。

1.3 實驗分組及其處理方法

（1）空白對照組（N組，n=10）：將小鼠心臟連接在Langendorff系統(tǒng)持續(xù)灌流，穩(wěn)定10 min后不采取任何特殊處理，持續(xù)進行灌流，處理的時間與其他組相同；（2）缺血再灌注組（IR 組，n=10）：穩(wěn)定10 min后，關閉灌注開關造成全心缺血，時間為30 min，此后打開灌注開關行再灌注120 min；（3）缺血后適應組（Post組，n=10）：在完成120 min再灌注前1 min內，迅速給予短暫停止灌流10 s后再恢復灌流10 s，此為1個循環(huán)，重復3個循環(huán)，共計60 s。

1.4 標本留取與指標檢測

1.4.1 心肌標本的采取及保存方法：各組心肌標本均在平衡灌注結束后，取下心臟于冰臺上將心臟剪成黃豆粒大小置于EP管中，于-70℃冰箱中保存Western blot備用，同樣方法取心尖部1 mm3組織用戊二醛固定后備電鏡用。

1.4.2 離體心臟冠狀動脈灌注流量（冠脈流量）的檢測：冠脈流量（ml/min）以單位時間內經心臟冠狀靜脈竇流出的灌注液量計算。心重指數=心臟質量（g）/體質量（g）×1000。

1.4.3 心肌梗死范圍的測定：在120 min再灌注結束后，迅速將心臟置于-20℃的冰箱中冷凍30 min后，將冷凍心臟從心尖至心底橫向切成薄片（每片厚度約0.8～1.0 mm）。將心臟薄片浸入36℃1%氯化三苯基四氮唑（1%TTC）磷酸鹽緩沖液中孵化30 min。存活組織中含有的乳酸脫氫酶可使其顯示出紅色，壞死心肌中因不含此成分而不顯色。染色后將心臟薄片以10%甲醛固定24 h，然后采用V2COM數字化彩色采相機拍照；用形態(tài)學分析軟件Image tool計測左心室梗死范圍。

1.4.4 Western blot檢測P-Akt的表達：分別稱取心肌組織約100 mg，加入PBS10 ml，勻漿。取上清液提取蛋白并測定蛋白濃度，電泳分離，轉印至醋酸纖維素膜，封閉，加入P-Akt一抗、二抗孵育，洗膜，顯色，Western blot結果量化。

1.4.5 透射電鏡標本的制作及觀察：取出已固定好的心肌組織，以蠟塊包裹。從蠟塊組織周邊取小塊組織（1 mm×1 mm×1 mm），二甲苯脫蠟，無水乙醇30 min2次，90%乙醇30 min，70%乙醇30 min，0.01 mol/L PBS浸泡30 min，4%戊二醛固定24 h（4℃），0.01 mol/LPBS洗15 min3次，1%鋨酸固定1～2 h，0.01 mol/L PBS洗15 min3次，常規(guī)脫水，Epon812浸泡，包埋，聚合，超薄切片，鈾-鉛雙染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠基本生理指標

各組大鼠在給予缺血處理以前的各項基本指標（體質量、心重指數、心率、冠脈流量）均未見明顯差異（P＞0.05）。

2.2 冠脈流量

各組大鼠缺血前的冠脈流量未見顯著差異（P＞0.05）。測定實驗開始時第 42 min、52 min、160 min 的冠脈流量，在42 min時，Post組與IR組相比，冠脈流量顯著增加（P<0.05）。在52 min、160 min時，Post組與IR組無顯著差異（P﹥0.05）。見表1。

2.3 心肌梗死范圍的測定

N組大鼠未見心肌梗死，Post組心肌梗死范圍（25.2±2.1）較 IR 組（47.5±3.5）小，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.4 Western blot檢測P-Akt的表達

各組大鼠心肌中均有P-Akt表達，但灰度值測定結果顯示 IR 組（45.2±3.4）與 N 組（45.7±3.5）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Post組P-Akt表達水平（71.5±4.8）較 IR 組（45.2±3.4）顯著升高（P<0.05）。見圖2。

2.5 電鏡觀察結果

N組大鼠心肌未見肌絲斷裂與線粒體空泡改變；IR組可見明顯的肌絲斷裂與廣泛的線粒體空泡改變；Post組心肌纖維和線粒體的完整程度較IR組好。見圖3。

3 討論

心肌保護是心臟外科手術及急性心肌梗死患者經皮冠狀動脈介入治療（PCI）最關鍵的部分，心肌缺血再灌注損傷已逐漸成為近年來研究的熱點。缺血預適應已被證實是一種確切的心肌保護措施，但因無法預計缺血發(fā)生的時機，該措施無法提前應用于心肌嚴重缺血甚至心肌急性梗死的患者［2，3］。

近期的研究表明，“缺血后適應”可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷，能夠產生與缺血預適應相當的心肌保護效果。Zhao等［1］首先提出經典后適應概念，即缺血再灌注后立刻給予1次或多次短暫重復心肌缺血與再灌注，能提高心肌對之前發(fā)生的較長時間缺血的耐受性。研究已初步證實，后適應在兔、犬、鼠心肌缺血與再灌注中具有改善缺血再灌注心臟的心功能、縮小梗死面積的作用，但其作用機制尚不明確［4～7］。

眾多的文獻報道［5～8］顯示，在經過單純缺血再灌注與缺血后適應處理后的冠脈流量是沒有統(tǒng)計學意義的。但本研究結果顯示，經后適應處理后的健康大鼠與未經此處理的缺血再灌注組相比，在再灌注的前幾分鐘內其冠脈流量的提高是有統(tǒng)計學意義的，說明缺血后適應可以減小再灌注初期的冠狀動脈痙攣的程度，使再灌注初期心肌的血液供應不至于太少，以達到保護心肌的效果［9，10］。

心肌梗死范圍的大小被認為是影響心功能最大的因素之一。本研究通過TTC染色的方法測定心肌梗死范圍，結果提示經過缺血后適應處理的心肌梗死范圍明顯較少?？梢娙毖筮m應可減小心肌梗死范圍，并起到保護心肌的作用。

目前認為PI3K-Akt是缺血后適應的關鍵酶之一［10～12］。Tsang 等及 Yang 等提出，缺血后適應通過PI3K及Akt的磷酸化發(fā)揮其心肌保護作用，進而認為PI3K-Akt-eNOS是介導后適應作用的主要途徑。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K最主要的靶酶，而eNOS是PI3K-Akt途徑的主要下游靶點。激活的Akt主要通過促進下游底物如合成酶激酶-3B等的磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。缺血后適應激活了Akt的磷酸化，增加了線粒體通透性轉換孔道對Ca2+超載的抵抗從而發(fā)揮保護作用。本研究也證實了在經過缺血后適應處理過的組別中，P-Akt有較高表達，從而同樣證實了缺血后適應的心肌保護作用是通過激活Akt來實現(xiàn)心肌的保護作用。

本研究中透射電鏡下觀察到缺血后適應組心肌纖維、線粒體更加完整，而缺血再灌注組心肌纖維則有較大的斷裂，線粒體空泡較多。因而從微觀方面說明了缺血后適應可以減輕心肌及線粒體的損害，從而達到保護心肌的作用。

本研究結果表明，缺血后適應對離體大鼠心肌也同樣有心肌保護作用，這種保護作用的實現(xiàn)有可能是多種機制共同作用的結果，其最終效應子可能是線粒體膜滲透轉變孔（mPTP）［6～11］，而缺血后適應調控mPTP的具體機制尚不清楚。我們推測，PI3KAkt-eNOS途徑可能是其作用機制之一。

在治療心肌缺血或梗死患者的臨床實踐中，與缺血預適應相比，缺血后適應更具有可行性。有文獻報道，急性心肌梗死患者冠狀動脈成形時予以缺血后處理，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷。所以缺血后處理心肌保護的信號途徑將是未來研究的方向，可能為心肌缺血再灌注損傷的臨床防治開辟新的途徑。

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