趙冬妮，金英楠，李艷霞，馬曉欣

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng)110004；2.北京市西城區(qū)疾病預(yù)防控制中心 生殖保健科，北京100029）

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因及其他多種因素的共同參與，是細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制紊亂的結(jié)果。抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡在腫瘤的預(yù)防和治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前，越來(lái)越多的研究表明，非甾體類(lèi)抗炎藥物阿司匹林能夠通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而降低胃癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生，對(duì)腫瘤具有一定的預(yù)防和治療作用［1，2］。本研究探討了阿司匹林對(duì)人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞株由北京大學(xué)病理生理教研室提供。阿司匹林購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)Chrome公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；RNaseA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將Ishikawa細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中貼壁傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組中分別加入含50，25，12.5，6.25，3.125，1.563 mmol/L阿司匹林的培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組細(xì)胞加入無(wú)藥物的培養(yǎng)基，空白對(duì)照組中無(wú)細(xì)胞只加無(wú)藥物的培養(yǎng)基。將按上述方法給藥的培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24，48，72 h 后，吸去上清液，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入200 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A）值。細(xì)胞抑制率=（陰性對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值）/（陰性對(duì)照組平均A值-空白組平均A值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率的變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入含終濃度為1，3，10 mmol/L阿司匹林的DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含阿司匹林的等量DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，以70%乙醇固定，加入100 μl RNaseA（1 mg/ml），置于37 ℃水浴30 min 后以 400 μl碘化丙錠（50 μg/ml）染色，置暗處10 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期比例及細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化：收取按上述方法（1.2.3）培養(yǎng)后的細(xì)胞，加入1 ml戊二醛（2.5%）固定，制成超薄切片，于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林作用后Ishikawa細(xì)胞增殖的抑制率

MTT比色法檢測(cè)顯示，阿司匹林濃度為1.56 mmol/L，作用時(shí)間為24 h時(shí)，細(xì)胞增殖受到輕度抑制（15.99%），隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，各濃度及時(shí)間點(diǎn)間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），阿司匹林對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量與時(shí)間依賴關(guān)系（表1）。半數(shù)抑制濃度（IC50）為 4.7 mmol/L，因此，以下實(shí)驗(yàn)選擇濃度為1 mmol/L，3 mmol/L，10 mmol/L。

2.2 阿司匹林對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期分布及凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，G1期細(xì)胞分布明顯增加，細(xì)胞凋亡率增加，對(duì)照組及各濃度實(shí)驗(yàn)組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3 阿司匹林作用后Ishikawa細(xì)胞的形態(tài)變化

透射電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞呈圓形，體積較大，形態(tài)飽滿，核內(nèi)常染色質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞表面可見(jiàn)絨毛（圖1A）；阿司匹林藥物作用后，細(xì)胞皺縮明顯，染色質(zhì)于核膜周?chē)吋?、固縮，形成新月體或花瓣形，電子密度增強(qiáng)，可見(jiàn)凋亡小體形成（圖1B）。

3 討論

1982 年，Doubilet［3］首次報(bào)道了長(zhǎng)期服用阿司匹林的人群較普通人群結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯降低，此后數(shù)項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)都得出了類(lèi)似的結(jié)論。Castano等［4］應(yīng)用阿司匹林作用于HT229結(jié)腸腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)HT229細(xì)胞的存活率與阿司匹林的劑量和處理時(shí)間相關(guān)；Moysich等［5］通過(guò)臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，規(guī)律服用阿司匹林可有效降低肥胖婦女子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率；Hector等［6］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能夠以劑量依賴的方式抑制體外Ishikawa子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡是這些變化的機(jī)制之一；Shiff等［7］研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可改變結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞聚集在G0/G1期，在一定濃度下誘導(dǎo)凋亡。

近年來(lái)，在非甾體類(lèi)抗炎藥物臨床應(yīng)用與研究的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)阿司匹林等具有防治腫瘤的作用。其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制主要分為依賴于環(huán)氧化酶-2（cyclo-oxygenase，COX-2）途徑和非COX-2途徑兩大方面。研究認(rèn)為，COX-2的活性增高可以引起前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）和Bcl-2的高度表達(dá)，降低E-鈣黏蛋白的活性而抑制細(xì)胞凋亡、刺激血管生成，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并增加惡性腫瘤的侵襲力。而阿司匹林可通過(guò)抑制環(huán)氧化酶使花生四烯酸至前列腺素的代謝通路受阻，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到化學(xué)預(yù)防和治療的作用。在非COX-2的途徑中，研究表明，阿司匹林可通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。˙celllymphoma/leukemia，BCL） 家族，c-myc，p53，caspase 等癌基因和抑癌基因，影響細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其發(fā)生凋亡。

本研究采用不同濃度的阿司匹林作用于Ishikawa細(xì)胞，在不同時(shí)間下觀察其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，阿司匹林對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)；同時(shí)，阿司匹林能抑制Ishikawa細(xì)胞的周期轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞停滯在G1期，阻礙G1/S期的轉(zhuǎn)換，阻止DNA合成，從而阻礙了細(xì)胞的分化和進(jìn)展。透射電鏡下見(jiàn)阿司匹林作用后的細(xì)胞發(fā)生皺縮，核染色質(zhì)邊集，凋亡小體形成，該形態(tài)學(xué)變化進(jìn)一步證明，阿司匹林可觸發(fā)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性死亡即凋亡的發(fā)生。

在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞增殖與凋亡機(jī)制的紊亂發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，阿司匹林能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，該藥物有望成為臨床上治療惡性腫瘤的又一重要手段。

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