吳剛，孫會東，楊蕾，陳旭春，程穎，劉永鋒

（1.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院肝膽外科，沈陽110001；2.山東省聊城市人民醫(yī)院 普外科，山東 聊城252000）

通過建立大鼠小體積肝臟模型，觀察脾切除對小肝綜合征（small-for-size syndrome，SFSS）發(fā)生的影響，探討SFSS發(fā)生內(nèi)在的機制，為臨床防治SFSS提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和動物模型的建立

雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g。大鼠小體積肝臟模型的建立：根據(jù)大鼠肝臟解剖結(jié)構(gòu)，切除80%肝組織，即規(guī)則切除左外葉、左內(nèi)葉、中葉、乳頭葉，保留肝右葉和錐體葉。

1.2 實驗分組

144只大鼠平均分為3組：脾切除組，切除80%肝組織后切除脾臟；對照組，切除80%肝組織；假手術(shù)組，僅肝臟游離，不做肝切除。分別于術(shù)后0，3，6，12，24 和 72 h 分批將大鼠處死（n=6），取血清和肝組織保存。每組留12只觀察術(shù)后1周生存率。

1.3 檢測指標

1.3.1 門靜脈壓力：經(jīng)腸系膜總靜脈插管測門靜脈壓力。

1.3.2 血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）：按ELISA檢測TNF-α試劑盒（北京邦定生物工程公司）說明書進行。

1.3.3 肝功能：檢測指標包括天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血清白蛋白（albumine，ALB）、總膽紅素（totalbilirubin，T-BIL）、膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）。

1.3.4 肝組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）：采用 Warren 等［1］的方法，以比活性（吸光度變化率/蛋白量）表示。

1.3.5 肝組織中TNF-α和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mRNA 的表達：采用TRIZOL一步法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）說明書合成cDNA。引物由大連寶生物工程有限公司合成，序列為：TNF-α（546 bp）：上游，5′-TGAATCTGTAGTGCCTCAGG-3′，下游，5′-CACGCTCTTCTGTCTACTGA-3′；PCNA（307 bp）：上游，5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，下游，5′-TCACCACAGCATCTCCAATAT-3′；β-actin（690 bp）：上游，5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′，下游，5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAG GAG-3′。PCR 反應體系為25 μl，TNF-α 反應條件：按 94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s，擴增35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min；PCNA 反應條件：按 94℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃60 s，擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。目的基因表達水平以目的條帶與β-actin條帶密度比值表示。

1.3.6 PCNA蛋白表達的免疫組織化學分析：PCNA單克隆抗體和S-P試劑盒購于福州邁新公司。PCNA陽性染色為肝細胞核呈棕黃色顆粒。結(jié)果采用圖像分析儀分析，以平均灰度值表示。

1.3.7 SFSS發(fā)生率：依據(jù)Dahmen等［2］提出的SFSS診斷標準，計算其發(fā)生率。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肝切除后門靜脈壓力變化及脾切除對門靜脈壓力的影響

肝切除后，對照組門靜脈壓力明顯升高，為（12.14±0.90）cmH2O，和假手術(shù)組（8.68±0.61）cm H2O相比有顯著差異（P<0.05）；脾切除組門靜脈壓力降低，為（11.11±0.80）cmH2O，和對照組相比差異顯著（P<0.05）。

2.2 脾切除對小體積肝臟肝功能的影響

肝切除后24 h，對照組血清ALT、AST、LDH和T-BIL水平明顯升高，ALB和CHE水平明顯下降，和假手術(shù)組相比有顯著差異（P<0.01）；脾切除組ALT、AST、LDH、T-BIL水平顯著降低，和對照組相比差異顯著（P<0.05）。見表1。

2.3 脾切除對小體積肝臟TNF-α和PCNAmRNA和蛋白表達及MPO活性影響

術(shù)后3h，對照組和假手術(shù)組相比，肝組織TNF-α mRNA 明顯升高（P<0.01），血清 TNF-α 含量亦顯著增加（P<0.01）；脾切除組和對照組相比，TNF-α mRNA表達和蛋白表達顯著降低（P<0.05）。術(shù)后24 h，對照組和假手術(shù)組相比，肝組織MPO活性亦明顯增高（P<0.01），肝組織PCNAmRNA表達和肝細胞核PCNA分子表達亦增強（P<0.01）；脾切除組和對照組相比，TNF-αmRNA表達和蛋白表達顯著降低，MPO活性減弱，但PCNAmRNA和蛋白表達更明顯（P均<0.05）。見表2。

2.4 SFSS的發(fā)生率和術(shù)后1周生存率

假手術(shù)組、對照組與脾切除組SFSS發(fā)生率分別為0、75%和25%，對照組和脾切除組相比差異顯著（P<0.05）。假手術(shù)組、對照組與脾切除組術(shù)后1周生存率分別為100%、50%和83.3%，對照組和脾切除組相比差異顯著（P<0.05）。

3 討論

SFSS是部分肝移植后或擴大肝切除后出現(xiàn)的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)為術(shù)后肝臟功能障礙、持續(xù)性膽汁淤積、凝血功能紊亂、門靜脈高壓，嚴重時可出現(xiàn)大量腹水，死亡率甚高，有近50%受體在術(shù)后4～6周死于敗血癥。目前多數(shù)學者認為SFSS的發(fā)病機制是部分肝移植或擴大肝切除導致的功能性肝臟體積過小和術(shù)后持續(xù)性的門脈過度灌注造成的［3］。如何預防及治療SFSS已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。

部分肝移植物或擴大肝切除后殘留肝臟有效血管床的減少，使得術(shù)后的一段時間里門靜脈血流增加、壓力升高［4］。門靜脈的血流和肝臟的體積呈負相關(guān)，即肝臟的體積越小，門靜脈的血流越快。這種門靜脈的血流增加狀態(tài)會一直持續(xù)到術(shù)后的幾個月。有研究顯示門靜脈超灌注是小體積肝移植物損傷的主要原因，早期門靜脈血流增加（＞2.6ml·min-1·g-1）和門靜脈高壓，對小體積移植物有明顯的損害作用，預后很差［5］。本實驗顯示擴大肝切除后，門靜脈壓力顯著增高，肝組織中TNF-αmRNA表達和蛋白表達明顯增強，肝組織中MPO活性亦明顯增高，說明中性粒細胞在肝組織中的浸潤明顯增加，肝細胞損害明顯。這說明擴大肝切除后門靜脈壓力增高，導致庫普弗細胞和肝竇內(nèi)皮細胞活化，釋放炎性細胞因子，介導中性粒細胞集聚并過度活化，釋放氧自由基和蛋白酶，對組織細胞造成損害。因此我們認為持續(xù)性的門靜脈高灌注和門靜脈高壓是SFSS發(fā)病的主要機制。

降低門靜脈灌流和壓力可能是預防SFSS的主要手段，Ito等［5］的研究表明，脾動脈結(jié)扎可使門靜脈壓力從10～20 mmHg（平均16 mmHg）降低到9～13 mmHg（平均11 mmHg），并且會持續(xù)到術(shù)后的1周，實踐證明實施脾動脈結(jié)扎患者的預后明顯好于那些門靜脈壓力增高而沒有實施脾動脈結(jié)扎的患者。本實驗顯示擴大肝切除后脾切除，門靜脈的壓力減低，肝組織TNF-αmRNA和蛋白表達量亦相應降低，MPO活性減弱，肝細胞損害減輕，SFSS發(fā)生率由75%降至25%。我們可以推測脾切除防治SFSS的可能機制為：脾切除有效地降低了擴大肝切除后門靜脈灌流和門靜脈的壓力，從而抑制促炎性細胞因子表達和釋放，減少了中性粒細胞集聚并過度活化，減輕肝細胞損害，降低了SFSS的發(fā)生率。

肝細胞的再生能力很強，移植術(shù)后肝細胞可以通過再生達到滿足機體所需要的體積［6］，但是肝細胞再生之前移植物必須提供受體即時所需的功能。另一方面，其再生能力受炎性細胞因子表達和釋放影響。通過誘導白細胞介素6（IL-6）、TNF-α的生成或IL-6信號轉(zhuǎn)導途徑可以降低了肝細胞的再生能力［7］。PCNA又稱周期蛋白，是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，它是DNA聚合酶的輔助蛋白，是細胞DNA合成不可缺少的因子，其表達常被用作評價細胞增殖狀態(tài)的一種指標［8］。本實驗結(jié)果顯示對照組擴大肝切除后24 h，肝組織PCNAmRNA和蛋白有一定程度的表達，但脾切除組其表達更為顯著。這說明脾切除在減輕肝損害的同時，促進肝細胞再生。小體積肝移植物或保留肝臟早期再生能力的缺乏意味著其損害的嚴重，是其功能性肝體積過小的一個重要標志，給患者的生命帶來威脅。

我們的實驗表明，脾切除確實可以促進小體積肝臟肝功能恢復和肝細胞再生，并能有效防治SFSS，其機制為脾切除降低門靜脈灌流和壓力，從而抑制促炎性細胞因子的表達和釋放，減輕中性粒細胞介導的肝細胞損害，促進肝再生。

［1］Warren JS，Yabroff KR，Remick DG，et al.Tumor necrosis factor participates in the pathogenesis of acute immune complex alveolitis in the rat［J］.J Clin Invest，1989，84（6）：1873-1879.

［2］Dahmen U，Madrahimov N，Madrahimova F，et al.Small-for-size syndrome in the rat：does size or technique matter? ［J］.J Surg Res，2008，149（1）：15-26.

［3］Demetris AJ，Kelly DM，Eghtesad B，et al.Pathophysiologic observations and histopathologic recognition of the portal hyperperfusion or small-for-size syndrome［J］.Am J Surg Pathol，2006，30 （8）：986-993.

［4］Tucker ON，Heaton N.The‘small for size’liver syndrome［J］.Curr Opin Crit Care，2005，11（2）：150-155.

［5］Ito T，Kiuchi T，Yamamoto H，et al.Changes in portal venous pressure in the early phase after living donor liver transplantation：pathogenesis and clinical implications［J］.Transplantation，2003，75（8）：1313-1317.

［6］Yoshizumi T，Taketomi A，Soejima Y，et al.The beneficial role of simultaneous splenectomy in living donor liver transplantation in patients with small-for-size graft［J］.Transplant Int，2008，21（9）：833-842.

［7］Debonera F，Wang G，Xie J，et al.Severe preservation injury induces IL-6/STAT3 activation with lack of cell cycle progression after partial live graft transplantation［J］.Am J Transplant，2004，4（12）：1964-1971.

［8］Buyukbayram H，Cureoglu S，Arslan A，et al.Prognostic value of PCNA and mutant p53 expression in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Cancer Invest，2004，22（2）：195-202.