范 斌,賀一原,朱道弘,2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲(chóng)行為與進(jìn)化生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南第一師范學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410205)

栗癭蜂(DryocosmuskuriphilusYasumatsu)屬膜翅目(Hymenoptera)癭蜂科(Cynipidea)栗癭蜂屬，每年發(fā)生1代，主要危害板栗(Castaneamollissima)，也危害茅栗(C.sequinii)和錐栗(C.henryi)．被害枝不能抽發(fā)新梢，嚴(yán)重時(shí)枯死，不僅影響當(dāng)年生長(zhǎng)和結(jié)果，而且影響次年的產(chǎn)量，是危害我國(guó)栗樹(shù)生長(zhǎng)和結(jié)果的主要害蟲(chóng)之一．該蟲(chóng)分布于陜西、湖北、湖南、福建等我國(guó)大部分板栗產(chǎn)區(qū)，日本、朝鮮等國(guó)也有報(bào)道[1-3]．

線粒體DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)是核外DNA，由于它具有分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，母性遺傳、替換速率相對(duì)快及缺少重組等特征，已成為昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)常被選擇的研究對(duì)象[4]．對(duì)于栗癭蜂而言，因?yàn)槠涮厥獾纳硻C(jī)制(孤雌生殖)，使得栗癭蜂線粒體DNA成為其進(jìn)化研究中一種有用的分子標(biāo)記．而16S rRNA基因又是線粒體上進(jìn)化速率中等的基因，適合于較高分類(lèi)單元的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化的研究．目前，國(guó)內(nèi)對(duì)栗癭蜂研究主要集中在生活史、發(fā)生規(guī)律和防治策略等方面，而分子水平研究尚未見(jiàn)報(bào)道．本研究以栗癭蜂線粒體內(nèi)16S rRNA基因作為分子標(biāo)記，對(duì)福建福州、湖南懷化、山東泰安、河北保定、湖南瀏陽(yáng)、廣西桂林6個(gè)栗癭蜂地理種群的線粒體DNA進(jìn)行了序列測(cè)定和分析，為我國(guó)栗癭蜂的分子進(jìn)化提供理論依據(jù)．

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用栗癭蜂的蟲(chóng)癭分別于2005年7月采自福建福州、湖南懷化、山東泰安、河北保定，2009年7月采自湖南瀏陽(yáng)、廣西桂林．采集的蟲(chóng)癭于實(shí)驗(yàn)室置于養(yǎng)蟲(chóng)籠(40 cm×40 cm×20 cm)內(nèi)保存，成蟲(chóng)羽化當(dāng)日收集的成蟲(chóng)以無(wú)水乙醇浸泡，于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 樣品DNA的提取

栗癭蜂1個(gè)體置于裝有100 μL STE 緩沖液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的Eppordef管(1.5 mL)內(nèi)，將其充分搗碎．加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS溶液10 μL，并加2 μL蛋白質(zhì)分解酶K(20 g/L)，以快速混勻器(XL96-B)混勻，置于電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1)內(nèi)，37 ℃水浴30 min．加100 μL PCL (苯酚、氯仿、異戊醇體積比為 25∶24∶1)進(jìn)行抽提，臺(tái)式離心機(jī)(TG16-WS)離心10 min，轉(zhuǎn)速為5000 r/min(下同)；提取上清液，再加100 μL PCL二次抽提，并二次離心(10 min)．離心后的抽提液加入10 μL NaAc(3 mol/L)和250 μL無(wú)水乙醇，-20 ℃過(guò)夜．過(guò)夜后的樣品以落地式冷凍離心機(jī)(J-25)低溫(5 ℃)離心20 min，轉(zhuǎn)速為14 000 r/min(下同)；去上清液，用體積分?jǐn)?shù)為75 %的冷無(wú)水乙醇洗滌后再低溫離心20 min，去上清液并常溫干燥．所得的DNA樣品加50 μL TE 緩沖液，于4 ℃過(guò)夜，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的上游、下游引物分別為：

5-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3；

5-TTAATTCAACATCGAGGTC-3[5](上海生工生物有限公司合成)

PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中10×Buffer(10 mmol/L)5 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，上下引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq 酶(2.5 mol·min-1·L-1)1 μL，DNA 1 μL，雙蒸水補(bǔ)足50 μL．?dāng)U增條件為96 ℃預(yù)變性3 min，接著進(jìn)行35個(gè)熱循環(huán)：96 ℃變性15 s，49 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)完成后在72 ℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠于0.5×TBE 緩沖液中電泳，電壓70 V，電泳時(shí)間約1 h．電泳后以溴化乙錠(EB)染色30 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照．DNA 分子量采用佳和生物科技有限公司的Mark DL2000標(biāo)記．每次PCR擴(kuò)增均設(shè)雙蒸水的陰性對(duì)照．

1.4 16S rRNA基因序列測(cè)定和分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物送北京天根生化科技有限公司純化回收，進(jìn)行雙向測(cè)序，以確保序列的可靠性．使用Clustal X 1.81軟件對(duì)所得栗癭蜂線粒體16S rRNA基因序列進(jìn)行排列比對(duì)，然后將序列在NCBI中用BLAST進(jìn)行相似性搜索，確定擴(kuò)增的片段為目標(biāo)基因序列．利用Mega 4.0中的雙參數(shù)模型計(jì)算各種群的遺傳距離，以落葉松種子小蜂(EurytomalaricisYano)為外群，并用鄰近法(NJ)，最小進(jìn)化法(ME)，非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMAN)重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中結(jié)點(diǎn)的自舉檢驗(yàn)置信度以1 000次自導(dǎo)復(fù)制計(jì)算估計(jì)．

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1可見(jiàn)，栗癭蜂16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，大約在430～470 bp之間，為實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的目的基因范圍，且條帶清晰無(wú)雜帶，選取亮而且清晰的條帶純化后測(cè)序．

2.2 6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列比較

經(jīng)Mega4.0軟件分析得出，保定種群、泰安種群、瀏陽(yáng)種群、福州種群、桂林種群、懷化種群這6個(gè)種群的差異非常明顯，堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換和顛換現(xiàn)象嚴(yán)重．

2.3 6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列組成分析

綜合從NCBI檢索獲得的其他栗癭蜂科中枝跗癭蜂(Ibalia)的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)80%以上，說(shuō)明所得序列為栗癭蜂科16S rRNA基因序列．利用Mega 4.0軟件統(tǒng)計(jì)出這6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因序列間變異位點(diǎn)和A、T、C、G的平均含量．其中，保守位點(diǎn)(C)88個(gè)，變異位點(diǎn)(V)270個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Pi)155個(gè)，自裔位點(diǎn)(Si)15個(gè)，分別占24.6%、75.4%、43.3%、32.1%．T、C、A、G堿基平均含量分別為42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明顯高于(C+G)含量(15.9%)．

2.4 6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因堿基轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及遺傳分析

根據(jù)16S rRNA基因序列，通過(guò)Mega4.0軟件分析出6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂的遺傳距離為0.168 4～0.538 7，平均遺傳距離為0.398 0．由表1可以看出桂林和懷化種群間的遺傳距離最小(0.168 4)，親緣關(guān)系最近；瀏陽(yáng)和桂林種群間的遺傳距離最大(0.538 7)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)．整個(gè)部分序列中，核苷酸的轉(zhuǎn)換/顛換(TS/TV)平均值為0.4，替換以顛換為主，并且各序列變異位點(diǎn)顛換多于轉(zhuǎn)換(表1)．

表1 目的基因16S rRNA的序列轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)與遺傳距離

注：對(duì)角線上三角的數(shù)據(jù)為轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)，對(duì)角線下三角的數(shù)據(jù)為遺傳距離.

當(dāng)轉(zhuǎn)換/顛換比值小于2.0時(shí)，此基因序列突變達(dá)到飽和狀態(tài)，受進(jìn)化噪音的影響可能性較大[6]．本研究中的6個(gè)地理種群的轉(zhuǎn)換/顛換比平均值為0.4，說(shuō)明栗癭蜂的突變已經(jīng)達(dá)到了飽和狀態(tài)，在重建系統(tǒng)樹(shù)時(shí)受飽和效應(yīng)的影響也越大．為了避免堿基替換飽和分析對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析的影響，本文以遺傳距離為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行散點(diǎn)分析(圖2)．分析結(jié)果顯示，顛換的數(shù)值明顯高于轉(zhuǎn)換的數(shù)值，隨著遺傳距離的增大，顛換數(shù)增加的速度大于轉(zhuǎn)換數(shù)，且轉(zhuǎn)換數(shù)趨于穩(wěn)定，而顛換數(shù)呈直線上升的趨勢(shì)．轉(zhuǎn)換和顛換的比率隨著遺傳距離的增加也并未出現(xiàn)飽和狀態(tài)，而是呈穩(wěn)定性的線性增長(zhǎng)，因此，在分析中將所有的轉(zhuǎn)換和顛換信息應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建．

M:Marker2000；1:保定；2:泰安；3:瀏陽(yáng)；4:懷化； 5:福州；6:桂林；7:陰性對(duì)照?qǐng)D1 栗癭蜂6地理種群16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增 圖2 栗癭蜂6地理種群堿基替換飽和分析

2.5 6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用Mega 4.0中的雙參數(shù)模型分析，以落葉松種子小蜂(EurytomalaricisYano)為外群，用鄰近法(NJ法)，最小進(jìn)化法(ME)，非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMAN)重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中結(jié)點(diǎn)的自舉檢驗(yàn)置信度以1 000次重復(fù)估計(jì)計(jì)算 (圖3～圖5)．

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的NJ樹(shù)

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的ME樹(shù)

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建不同地理種群的栗癭蜂的UPGMAN樹(shù)

利用NJ、ME、UPGMAN分析得到的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，6個(gè)不同地理種群大致可以分為兩個(gè)支系，第一個(gè)支系由保定、瀏陽(yáng)、泰安種群組成，并有著極高的置信度(100%)，說(shuō)明這三者之間具有較近的親緣關(guān)系；第二個(gè)支系由福州、桂林、懷化種群組成，前期已經(jīng)出現(xiàn)分化，且置信度相對(duì)較低．從總體上看，這6個(gè)地理種群在聚類(lèi)上呈現(xiàn)出一種平行式的分布關(guān)系，并沒(méi)有因?yàn)榈乩憝h(huán)境的遠(yuǎn)近而顯示出相應(yīng)的差異性，如空間位置相距較遠(yuǎn)的瀏陽(yáng)和泰安種群并不一定存在大的差異，而較近的懷化和瀏陽(yáng)種群的差異反而更加顯著．

3 結(jié)論與討論

mtDNA 16S rRNA既具有保守性，又具有高變性．保守性能夠反映出物種的親緣關(guān)系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索，高變性則能揭示出物種的特征核苷酸序列，是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)．目前國(guó)內(nèi)外對(duì)昆蟲(chóng)16S rRNA的報(bào)道較多，但對(duì)栗癭蜂的16S rRNA研究還尚未見(jiàn)報(bào)道，而對(duì)栗癭蜂的研究又主要集中在對(duì)其生物學(xué)特性、發(fā)生和防治等方面，如任淑艷[7]，黃漢杰[8]等；在分子水平上的研究也僅見(jiàn)于賀一原[1-2]和朱道弘[1-2]對(duì)栗癭蜂的Wolbachia感染研究．國(guó)外對(duì)癭蜂科的其他種研究較多，如Dowton M.[9]對(duì)枝跗癭蜂(Ibalia)16S rRNA的研究，Buennige M.[10]對(duì)食榕小蜂(Sycophila)的研究等．本研究對(duì)我國(guó)栗癭蜂線粒體DNA 16S rRNA基因序列測(cè)定和分析，在一定程度上能為栗癭蜂的系統(tǒng)演化提供分子生物學(xué)方面上的證據(jù)．

對(duì)基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，T、C、A、G堿基平均含量分別為42.6%、8.1%、41.5%、7.8%，其中(A+T)含量(84.1%)明顯高于(C+G)含量(15.9%)，表現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏嗜，且A和T堿基含量相當(dāng)，這與Simon[11]等報(bào)道的昆蟲(chóng)線粒體基因的堿基組成特征基本一致．本文所示的6個(gè)不同地理種群的栗癭蜂16S rRNA基因片段中具有較多的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失現(xiàn)象，這可能是由于16S rRNA基因是一非編碼蛋白基因，在進(jìn)化中所受到的選擇壓力相對(duì)較小的緣故[12]．

盡管建樹(shù)方法的設(shè)置參數(shù)不同，但是，這6個(gè)不同地理種群的分化趨勢(shì)大致相同，即：泰安、保定、瀏陽(yáng)種群親緣關(guān)系較近，福州、桂林、懷化種群分化程度較高．分化原因可能與栗癭蜂的生活習(xí)性相關(guān)，因栗癭蜂的遷飛能力弱，很難遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移，在地理隔離的作用下，栗癭蜂由于寄主、氣候等外界環(huán)境因素的影響，向著適應(yīng)自己環(huán)境的方向進(jìn)化．另一方面，種群突變和遺傳漂變也是導(dǎo)致遺傳距離差異的重要因素．

系統(tǒng)拓?fù)錁?shù)上的有些分支的置信度不是太高，許多低于70，如NJ上的保定種群和瀏陽(yáng)種群甚至低到49，其原因可能是所研究的序列片段太短(450左右)，不能提供足夠的遺傳信息[13]．另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所選擇的地理種群少，并沒(méi)有完全反映出我國(guó)栗癭蜂不同地理種群的遺傳分化特征，因此對(duì)我國(guó)不同地理種群的栗癭蜂遺傳分化還有待進(jìn)一步探討．

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