陳平 姚瑋艷 章永平 喬敏敏 袁耀宗

·論著·

雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎體外細(xì)胞模型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究

陳平 姚瑋艷 章永平 喬敏敏 袁耀宗

目的觀察急性胰腺炎(AP)體外細(xì)胞模型Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞因子表達(dá)的變化，探討其機(jī)制。方法應(yīng)用雨蛙素處理大鼠胰腺外分泌細(xì)胞株AR42J細(xì)胞建立AP體外模型，再用雷帕霉素 (RPM) 及AG490干預(yù)。采用Western blotting檢測細(xì)胞JAK1、磷酸化JAK1(P-JAK1)、STAT1、P-STAT1及TNF-α、 IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平；RT-PCR檢測TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)；臺(tái)盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率。結(jié)果未經(jīng)雨蛙素處理的AR42J細(xì)胞的JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1及TNF-α、 IL-1β、IL-6蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.09±0.04、0.14±0.08、0.21±0.09、0.12±0.12、0.10±0.02、0.08±0.03、0.02±0.02。雨蛙素處理后，AR42J細(xì)胞上述蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，24 h時(shí)的表達(dá)量分別為0.53±0.09、0.53±0.13、0.56±0.09、0.55±0.10、0.25±0.04、0.25±0.09、0.27±0.07，均較雨蛙素未處理組顯著增加(P<0.05)。再分別應(yīng)用RPM和AG490抑制24 h后， 細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)量顯著降低到0.17±0.03和0.17±0.01、0.15±0.05和0.14±0.07、0.19±0.04和0.19±0.05，它們的mRNA 表達(dá)量也顯著降低(P值均<0.05)；RPM和AG490抑制組的細(xì)胞存活率分別為(72.4±11.2)%、(69.7±9.8)%，均顯著高于單用雨蛙素處理細(xì)胞組的(42.2±12.3)%(P<0.05)。結(jié)論JAK1/STAT1信號(hào)通路早期參與雨蛙素誘導(dǎo)的AP細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子釋放。早期抑制JAK1/STAT1信號(hào)通路有利于控制AP的炎癥反應(yīng)。

胰腺炎； Janus激酶1； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子1； 炎癥； 細(xì)胞因子類

Janus激酶 (Janus kinase，JAK)和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal transducer and activator of transcription, STAT) 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，參與細(xì)胞凋亡、急性肺損傷、膿毒性休克等病理過程[1]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雨蛙素處理大鼠胰腺外分泌細(xì)胞株AR42J細(xì)胞構(gòu)建體外急性胰腺炎(AP)模型，觀察JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要蛋白JAK1、STAT1和主要促炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)的相關(guān)性，從而揭示治療疾病的新靶點(diǎn)。

材料及方法

一、細(xì)胞株的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J細(xì)胞株購自美國ATCC公司，常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24～72 h，分為PBS對(duì)照組、雨蛙素(10-8mol/L)處理組(雨蛙素組)、雷帕霉素(RPM, 50 ng/ml)+雨蛙素(10-8mol/L)處理組(RPM組)和AG490(50 μmol/ml)+ 雨蛙素(10-8mol/L)處理組(AG490組)。雨蛙素培養(yǎng)6、12、24、48 h分批收獲細(xì)胞，后兩組培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

二、JAK1、磷酸化-JAK1(P-JAK1)、STAT1、P-STAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白檢測

先用RIPA分裂液(申能博彩公司) 抽提各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法行蛋白的定量 (Pierce公司)。然后采用常規(guī)Western blotting方法檢測蛋白表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照?？笿AK1、P-JAK1、STAT、P-STAT1 一抗(cell signaling 公司)工作濃度為1∶1000；抗TNF-α、IL-1β、IL-6一抗(Santa cruz公司)工作濃度為1∶200；抗GAPDH一抗(上?？党晒?工作濃度為1∶10 000。ECL(Amersham Biosciences公司)發(fā)光后，壓片、沖洗、顯影。采用Bio-Rad公司數(shù)碼成像系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行掃描，Quantity One軟件灰度分析，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值比作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA檢測

應(yīng)用Trizol試劑 (Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用Primer 5程序設(shè)計(jì)引物：IL-6上游5′-TGCCTTCTTGGGACTGAT-3′，下游5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3′；IL-1β上游5′-TCTGTGACTCGTGGGATG-3′，下游5′-TCTTTGGGTATTGTTTGG-3′；TNF-α上游5′-TCTCATTCCTGCTCGTGG-3′，下游5′-CCATTGGCCAGGAGGGCGTTGG-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTC-3′，下游5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。引物由上海英駿生物公司合成。采用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生物工程技術(shù)有限公司)合成cDNA。RT-PCR檢測mRNA 表達(dá)。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃45 s、55℃(GAPDH)或58℃(IL-6、IL-1β)或60℃(TNF-α)45 s、72℃45 s， 35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝影，Quantity One軟件灰度分析，以目的基因mRNA與GAPDH mRNA灰度比值作為mRNA相對(duì)表達(dá)量。

四、細(xì)胞存活率檢測

采用臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒(碧云天生物公司)，嚴(yán)格按說明書操作。細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-壞死細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)× 100%

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表達(dá)

雨蛙素組JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加(圖1)， JAK1于6 h，P-JAK1、STAT1、P-STAT1于12 h表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05,表1)。

圖1雨蛙素組和對(duì)照組JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1蛋白表達(dá)(Western blotting)

二、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)

雨蛙素組IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)也呈時(shí)間依賴性增加(圖2)。IL-1β、TNF-α在6 h，IL-6在12 h的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P值均<0.05，表1)。

圖2雨蛙素組和對(duì)照組IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)(Western blotting)

三、STAT抑制劑RPM及JAK抑制劑AG490對(duì)雨蛙素組細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)的影響

RPM、AG490 處理雨蛙素組細(xì)胞后，細(xì)胞的IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)均較雨蛙素未處理組顯著降低(P值均<0.05，圖3、表2)，但兩處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，兩處理組細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)。

圖3各組細(xì)胞IL-6 、IL-1β、TNF-α蛋白(a)和mRNA(b)表達(dá)

四、細(xì)胞存活率

對(duì)照組、雨蛙素組、RPM組和AG490組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞存活率分別為(80.4±7.2)%、(42.2±12.3)%、(72.4±11.2)%和(69.7±9.8)%，雨蛙素組較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，RPM組和AG490組較雨蛙素組顯著增高(P<0.05)，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 雨蛙素處理前、后AR42J細(xì)胞JAK1、P-JAK1、STAT1、P-STAT1、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與6 h組比較，bP<0.05

表2 RPM、AG490處理24 h后各組AR42J細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)的變化

注：與雨蛙素組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.05

討 論

Robinson等[2]報(bào)道，TNF-α處理胰腺腺泡細(xì)胞后細(xì)胞STAT1、STAT3蛋白表達(dá)增高；而YY肽抑制STAT1、STAT3蛋白表達(dá)，并減輕其誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放。Gallmeier等[3]報(bào)道，干擾素γ可誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞JAK2和STAT1蛋白的活化表達(dá)。Simovic等[4]通過構(gòu)建AP肺損傷動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)STAT6敲除小鼠于制模后1～6 h出現(xiàn)肺損傷，但12 h后損傷減輕；而STAT4敲除小鼠于制模后1～6 h僅出現(xiàn)輕度肺損傷， 12 h后損傷加重，但均較野生型小鼠的肺損傷有所減輕，提示STAT參與AP肺損傷機(jī)制，但不同類型的STAT的作用有所不同。本實(shí)驗(yàn)通過雨蛙素處理胰腺腺泡細(xì)胞株AR42J建立AP的體外模型[5]，結(jié)果顯示JAK1及STAT1表達(dá)和活化呈時(shí)間依賴性增加，也證明JAK1/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞損傷機(jī)制。

IL-1β、TNF-α是觸發(fā)失控性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵促炎癥細(xì)胞因子之一[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雨蛙素處理后AR421細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)均與JAK1、STAT1蛋白表達(dá)同步增高，提示在AP中促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)可能與JAK1/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化有關(guān)。

RPM是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和免疫抑制劑，通過阻斷STAT上酪氨酸殘基的磷酸化而抑制激酶的激化，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)和蛋白合成[8]。AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二睛的脂類衍生物，通過阻斷JAK 701位酪氨酸或727位絲氨酸磷酸化，從而阻斷下游激酶的活化進(jìn)而抑制細(xì)胞因子的生理和病理效應(yīng)[9]。

本實(shí)驗(yàn)使用RPM和AG490處理雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞，結(jié)果顯示培養(yǎng)24 h后細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)均較雨蛙素組細(xì)胞明顯下調(diào)，細(xì)胞的存活率顯著增加，提示負(fù)性調(diào)控JAK1/STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制病程中促炎癥細(xì)胞因子的釋放，減輕雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞損傷。

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2009-08-14)

(本文編輯：呂芳萍)

Expressionofjanuskinase1/signaltransducerandactivatoroftranscription1signalingpathwayinceruleanstimulatedpancreaticacinarcells

CHENPing,YAOWei-yan,ZHANGYong-ping,QIAOMin-min,YUANYao-zong.

TheDepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the activity of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signaling pathway in cerulein-induced pancreatic acinar cell line AR42J.MethodsThe in vivo model of AP was induced by cerulean treated pancreatic acinar cell line AR42J, then RPM and AG490 were given for intervention. Western blot was used to determine the expressions of JAK1 and phosphorylation JAK1 (P JAK1), STAT1, PSTAT1 and TNFα, IL-1β, IL-6. The expressions of IL-6, IL-1β, and TNFα mRNA were measured by RT-PCR. Survival rate of cells was evaluated by trypan blue stain.ResultsThe relative expressions of JAK1, P JAK1, STAT1, P STAT1 and TNF-α, IL-1β, IL 6 without cerulean treatment were 0.09±0.04,0.14±0.08,0.21±0.09,0.12±0.12,0.10±0.02,0.08±0.03,0.02±0.02. After cerulean treatment, the expressions of abovementioned protein increased in a time-dependant manner, the expressions at 24h were 0.53±0.09,0.53±0.13,0.56±0.09,0.55±0.10,0.25±0.04,0.25±0.09,0.27±0.07, which were significantly higher than those in the control group (P<0.05). 24 h after RPM and AG490 inhibition, the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-6 proteins significantly decreased to 0.17±0.03and0.17±0.01,0.15±0.05and 0.14±0.07, 0.19±0.04and0.19±0.05; their expressions of mRNA significantly decreased (P<0.05). The cell survival rates in RPM and AG490 treatment group were (72.4±11.2)%, (69.7±9.8)%, and in cerulein-stimulated cells (42.2±12.3)% (P<0.05).ConclusionsThe JAK1/STAT1 signaling pathway was involved in pancreatic inflammatory response with cerulein stimulation. Early treatment with inhibitors to the JAK1/STAT1 signaling pathway might control the inflammatory response in acute pancreatitis.

Pancreatitis; Janus kinase 1； Signal transducer and activator of transcription 1； Inflammation； Cytokines

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.015

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科

袁耀宗，Email:yyz28@medmail.com.cn