張富春 吳婷 黃胡萍 孫娟

伴高脂血癥的急性胰腺炎大鼠腸屏障功能的改變

張富春 吳婷 黃胡萍 孫娟

近年來高脂血癥與急性胰腺炎(AP)之間的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。高脂血癥已成為AP的一個較常見的病因，并能誘發(fā)和加重AP的病情進展，但具體機制尚未闡明。由于近年來腸道屏障功能障礙在AP病情進展中所起的作用得到揭示，故本實驗試圖從腸道屏障功能改變方面對高脂血癥與AP之間的關(guān)系做一探討。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：清潔級SD大鼠50只，雌雄不分，體重200～220 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按數(shù)字表法隨機分為4組，高脂血癥并急性胰腺炎(HAP)組(15只)、AP組(15只)、高脂血癥(HL)組(10只)和對照組(10只)。采用自制脂肪乳劑灌胃(1 ml·100 g-1·d-1，連續(xù)2周)的方法制備HL模型。脂肪乳劑配方參照劉明等[1]方法加以改進，配方中各種成分的比例為：20%豬油，10%膽固醇，20%吐溫80，2%膽酸鈉，1%丙基硫氧嘧啶。采用胰膽管逆行注射3.5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重方法制備AP模型。對照組僅行剖腹術(shù)，輕輕牽動十二指腸及胰腺。

2．血清淀粉酶、三酰甘油(TG)、膽固醇(CH)、D-乳酸、內(nèi)毒素含量測定：制備模型后6 h采血,自動生化儀測定大鼠血清淀粉酶、TG及CH含量；改良分光光度法[2]測定血漿D-乳酸水平；EDS-99細(xì)菌內(nèi)毒素測定系統(tǒng)測定血漿內(nèi)毒素水平。

3．胰腺、回腸組織病理檢查：取胰腺和回腸組織行常規(guī)病理組織學(xué)觀察，參照Grewal等[3]的標(biāo)準(zhǔn)對胰腺損害進行評分。

4．回腸末段組織凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)及PCNA表達(dá)檢測：采用TUNEL檢測試劑盒(德國ROCHE公司)原位檢測回腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況。計數(shù)3個視野中每100個上皮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞(棕黃色染色)數(shù)，取均值，為AI；采用常規(guī)免疫組化法檢測回腸黏膜上皮細(xì)胞PCNA的表達(dá)，PCNA抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，以PBS代替PCNA抗體作為陰性對照。細(xì)胞核呈棕色者為陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率。

二、結(jié)果

1．模型評估：AP組及HAP組血清淀粉酶值較對照組明顯升高(P﹤0.01)，HL組和HAP組血清TG、CH值較對照組均明顯升高(P﹤0.01，表1)。AP組及HAP組胰腺病理評分較對照組明顯升高，對照組及HL組胰腺組織未見改變，各組胰腺組織病理評分見表1。表明兩種模型均制備成功。

2．血D-乳酸和內(nèi)毒素水平變化：AP組血D-乳酸和內(nèi)毒素水平較對照組均明顯升高(P﹤0.01)，HAP組血D-乳酸及內(nèi)毒素水平又均較AP組顯著升高(P﹤0.05，表1)。

表1 各組血清淀粉酶、TG、CH、D-乳酸和內(nèi)毒素水平變化及胰腺病理評分

注：與對照組比較，aP﹤0.05，bP﹤0.01；與AP組比較，cP﹤0.05

3．回腸組織病理改變及回腸上皮細(xì)胞AI、PCNA表達(dá)的變化：各組回腸組織學(xué)改變未見明顯區(qū)別。對照組、AP組、HAP組的AI分別為5.200±1.121、15.348±1.446、25.915±1.939(圖1)； PCNA陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為(79.3±7.0)%、(67.3±5.9)%、(53.8±7.5%)。AP組的AI較對照組顯著增加，而PCNA表達(dá)較對照組顯著減少(P值均<0.01)；HAP組的AI較AP組進一步增加，PCNA表達(dá)較AP組進一步減少(P值均<0.05，圖2)。

圖1 AP組(a)和HAP組(b)小腸細(xì)胞凋亡情況(Tunel ×400)

圖2AP組(a)和HAP組(b)小腸細(xì)胞PCNA表達(dá)情況(免疫組化×400)

討論高脂血癥與AP之間孰因孰果目前仍存在爭議。當(dāng)前的多數(shù)研究認(rèn)為高脂血癥可導(dǎo)致或加重AP[4-5]，極高的TG可以直接誘發(fā)AP。Berger等[6]報道，血清TG水平濃度超過11.3 mmol/L就能引起胰腺炎。高脂血癥引起或加重胰腺炎的具體機制為：(1)HL使血液黏稠度增高，微血栓形成，造成胰腺微循環(huán)障礙；(2)血清脂質(zhì)顆粒聚集栓塞胰腺血管，或胰腺內(nèi)黃色瘤形成；(3)HL激活血小板，釋放大量具有強烈縮血管作用的血栓素A2，同時損傷胰腺血管內(nèi)皮細(xì)胞，前列腺環(huán)素分泌減少，導(dǎo)致兩者失衡，加重胰腺微循環(huán)障礙；(4)胰脂酶水解TG產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，產(chǎn)生組織毒性。本結(jié)果顯示，HAP組大鼠胰腺病變，尤其是胰腺壞死程度較AP組明顯加重，證實HL可加重AP病情的進展。

近年來腸屏障功能障礙在重癥急性胰腺炎(SAP)的發(fā)病機制中受到很大關(guān)注，SAP時腸屏障功能障礙是加重SAP病情進展的一個重要因素[7-8]。D-乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，可由腸道多種細(xì)菌產(chǎn)生。因哺乳動物不具備將其分解的酶系統(tǒng)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過受損腸黏膜進入血，引起外周血中D-乳酸的水平升高，故血中D-乳酸水平可反映腸通透性的變化[9]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，正常情況下只有少量內(nèi)毒素進入循環(huán)并在肝臟內(nèi)被滅活，外周循環(huán)中檢測不到。在各種原因引起腸道屏障功能減弱時，大量的內(nèi)毒素即可通過各種途徑進入到循環(huán)中，形成內(nèi)毒素血癥[10]。本實驗結(jié)果顯示， HAP組的血D-乳酸和內(nèi)毒素的水平均較AP組明顯升高，說明HAP大鼠的腸黏膜通透性較AP組增加。實驗結(jié)果還顯示， HAP組大鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞的AI較AP組顯著增加，而PCNA的表達(dá)則明顯減少，提示腸黏膜上皮細(xì)胞過度凋亡與增殖減弱可能是導(dǎo)致HAP大鼠腸道屏障功能障礙加劇、通透性進一步增加的一個重要機制之一。

[1] 劉明，董超仁，蘇靜怡.一種簡便實用的大鼠高脂血癥模型.中國藥理學(xué)通報,1989,5:119-120.

[2] Brandt RB，Siegel SA，Waters MG，et al．Spectrophotometric assay for D-(-)-lactate in plasma．Anal Biochem， 1980,102：39-46.

[3] Grewal HP,Mohey el Din A,Gaber L,et al.Amelioration of the phy-siologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF-alpha polyclonal antibody.Am J Surg,1994,167:214-219.

[4] Tsuang W, Navaneethan U, Ruiz L,et al. Hypertriglyceridemic pancreatitis: presentation and management.Am J Gastroenterol,2009，104:984-991.

[5] Fortson MR,Freedman SN,Webster PD 3rd. Clinical assessment of hyperlipidemic pancreatitis.Am J Gastroenterol,1995,90:2134-2139.

[6] Berger Z,Quera R,Poniachik J,et al.Heparin and insulin treatment of acute pancreatitis caused by hypertriglyceridemia.Experiences of 5 cases.Rev Med Chil,2001,129:1373-1378．

[7] Marotta F,Geng TC,Wu CC,et al.Bacterial translocation in the course of acute pancreatitis:beneficial role of nonabsorbable antibiotics and lactitol enemas.Digestion,1996,57:446-452.

[8] Miniello S,Testini M,Amoruso M.Acute pancreatic necrosis complicated by infection and gastro-intestinal translocation:pathogenesis correlation and therapeutic implication.Ann Ital Chir,2002，73:611-617.

[9] 陳秀凱,邱方,程愛國.腸道屏障功能監(jiān)測方法的現(xiàn)狀及其進展. 中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2002，5:413-415.

[10] 鄧群，黎沾良，陸連榮，等.急性壞死性胰腺炎腸粘膜屏障改變與腸源性細(xì)菌移位及內(nèi)毒素血癥的關(guān)系. 中華實驗外科雜志,2000,17：471.

2009-08-17)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.023

350003 福州，福建省老年醫(yī)院消化內(nèi)科(張富春)；福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(吳婷)；福建省立醫(yī)院消化內(nèi)科(黃胡萍)；福州市第一醫(yī)院消化內(nèi)科(孫娟)

吳婷，Email:DrWT@medmail.com.cn