沈銳潮 陳燕昌 黃鶴光

·短篇論著·

羥乙基淀粉130/0.4對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠腎組織水通道蛋白1表達(dá)的影響

沈銳潮 陳燕昌 黃鶴光

重癥急性胰腺炎(SAP)常并發(fā)多器官功能不全綜合征，在胰外器官損害中腎功能障礙發(fā)生率僅次于肺功能障礙[1],位列第二。SAP早期大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放造成內(nèi)皮細(xì)胞破壞引起毛細(xì)血管滲漏增加是造成胰性腎病的重要發(fā)病機(jī)制。本文應(yīng)用羥乙基淀粉130/0.4(HES 130/0.4)對(duì)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠進(jìn)行液體復(fù)蘇，觀察HES 130/0.4對(duì)ANP時(shí)腎功能障礙的影響，并探討其作用機(jī)制。

一、材料和方法

1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和模型制備：雄性SD大鼠48只，體重200～250 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)：SCXK滬2007-0005)。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、ANP組及HES組。參照楊波等[2]方法，胰膽管逆行注入5%?；悄懰徕c1.0 ml/kg體重制作ANP模型。HES組在制模后經(jīng)股靜脈滴注HES 130/0.4 15 ml/kg體重[3]。對(duì)照組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)十二指腸及胰腺后關(guān)腹。術(shù)后6、24 h下腔靜脈采血，離心取血清，-80℃凍存。迅速切取腎臟，一個(gè)置液氮凍存，一個(gè)甲醛固定。

2．檢測(cè)指標(biāo)和方法：血清淀粉酶、肌酐、尿素氮含量采用全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)。血清TNF-α檢測(cè)按照ELISA試劑盒(武漢博士德公司)說(shuō)明書(shū)操作。

胰腺、腎臟組織行常規(guī)病理學(xué)檢查，腎臟病理?yè)p害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]。

腎組織水通道蛋白1(aquqporin-1,AQP1)mRNA表達(dá)采用RT-PCR方法檢測(cè)。應(yīng)用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)抽提腎組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA后PCR擴(kuò)增。AQP1上游引物5′-TGGCTTGTCTGTGGCTCTTG-3′，下游引物5′-ATCAGCATCCAGGTCATACTCC-3′，擴(kuò)增片段259 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′，擴(kuò)增片段150 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s， 35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，以AQP1與β-actin擴(kuò)增片段的灰度值比值作為AQP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

腎組織AQP1蛋白表達(dá)應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)。鏡下觀察AQP1的表達(dá)，采用Imagepro plus數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，獲取3個(gè)高倍視野的陽(yáng)性染色面積的積分光密度值，取平均值表示蛋白表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α的變化：ANP組血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α水平均較對(duì)照組明顯升高(P﹤0.01)；HES組較ANP組顯著下降(P﹤0.01)，但仍顯著高于對(duì)照組(P﹤0.01，表1)。

表1 各組血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、TNF-α的變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

2．胰腺、腎臟病理學(xué)改變：對(duì)照組胰腺和腎臟組織未見(jiàn)明顯異常。ANP組胰腺腫大、出血壞死，大網(wǎng)膜、腸系膜、后腹膜上可見(jiàn)皂化斑，鏡下見(jiàn)胰腺組織水腫明顯，大片狀出血、壞死灶，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至形成膿腫，胰周脂肪壞死(圖1a)；腎小球腫脹、嚴(yán)重淤血，間質(zhì)水腫明顯，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管片狀水腫、變性，部分壞死，細(xì)胞界限模糊(圖1b)。HES組胰腺和腎臟病理炎癥改變較ANP組減輕，腎臟組織病理分級(jí)降低(表2)。

圖1 ANP組6 h的胰腺(a) 、腎臟(b)病理改變(HE ×100)

組 別只數(shù)0級(jí)Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)對(duì)照組6h88000 24h88000ANP組6h80242 24h80035HES組6h80431 24h80242

3．腎臟AQP1 mRNA表達(dá)的變化：對(duì)照組、ANP組和HES組6 h點(diǎn)的AQP1 mRNA表達(dá)量分別為0.696±0.037、0.395±0.027、0.662±0.027；24 h分別為0.699±0.039、0.299±0.016、0.531±0.013。組間比較相差均顯著(P值均﹤0.05，圖2)。

圖2對(duì)照組(1)、ANP組(2)、HES組(3)腎臟AQP1 mRNA的表達(dá)

4．腎臟AQP1蛋白表達(dá)的變化：對(duì)照組、ANP組和HES組6 h的AQP1蛋白表達(dá)量分別為249804.2±54372.6、64971.0±21203.1、132176.5±19406.7；24 h分別為252320.4±48144.9、65268.7±21258.6、130403.8±15604.3。組間比較相差均顯著(P值均﹤0.05，圖3)。

圖3對(duì)照組(a)、ANP組(b)、HES組(c)24 h時(shí)腎臟AQP1蛋白的表達(dá)(免疫組化 ×400)

討論急性腎功能障礙是SAP常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其機(jī)制為：(1)腎臟血流動(dòng)力學(xué)的異常。SAP急性期毛細(xì)血管通透性增加，大量炎性滲液和組織液進(jìn)入第三間隙，造成全身有效循環(huán)血量的嚴(yán)重不足，腎血流量減少，微循環(huán)灌注不足；(2)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的作用。SAP體內(nèi)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子激活后級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)產(chǎn)生大量高濃度、有活性的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，直接作用損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞；(3)大量炎性滲液形成的腹腔高壓。由于大量炎性滲液和組織液滲入腹腔，使腹腔壓力明顯增高，腹腔高壓影響腎臟的動(dòng)脈血供和靜脈回流，加劇了腎功能的損傷。其中腎臟微循環(huán)灌注不足被視為引發(fā)腎臟損害的恒定因素[5]。

AQP1在腎臟中主要分布于近曲小管和髓袢降支的頂質(zhì)膜和側(cè)膜上。它主要作用是重吸收腎小球?yàn)V液的80%～90%，對(duì)紅細(xì)胞通過(guò)腎臟內(nèi)髓高滲環(huán)境起保護(hù)作用。體外實(shí)驗(yàn)證明，AQP1缺失將降低近曲小管和髓袢降支細(xì)段滲透性，液體重吸收能力降低，逆流倍增系統(tǒng)受到破壞[6]。缺血造成的急性腎功能衰竭存在AQP1表達(dá)的下降[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠腎臟組織出現(xiàn)病理性改變，AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，表明AQP1在SAP腎功能損害中起重要作用。

HES 130/0.4可以提供穩(wěn)定可靠的容量效應(yīng)和持續(xù)灌注，快速增加組織氧分壓，改善微循環(huán)，減少炎癥反應(yīng)，還具有防止和堵塞毛細(xì)血管滲漏作用[8]。有研究報(bào)告，HES 130/0.4有減輕膿毒血癥引起的肺毛細(xì)血管滲漏和抑制炎癥介質(zhì)TNF-α的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HES組大鼠血清TNF-α明顯下降，腎臟AQP1的表達(dá)增加，推測(cè)HES 130/0.4可能通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)TNF-α釋放并增強(qiáng)腎AQP1的表達(dá)，從而改善ANP大鼠腎功能的障礙。

[1] Pupelis G.Renal failure in acute pancreatitis.Timing of dialysis and surgery.Przegl Lek，2000，57：29-31.

[2] 楊波，黃鶴光，陳大良，等.逆行性胰膽管注射法制作重癥急性胰腺炎大鼠模型.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，36：71-72.

[3] Tian J，Lin X，Li YH，et al.Influence of hydroxyethyl starch on lipopolysaccharide-induced tissue nuclear factor kappa B activation and systemic TNF-alpha expression.Acta Anaesthesiol Scand，2005，49：1311-1317.

[4] 雷文章，韋靖江，沈文律，等.實(shí)驗(yàn)性壞死性胰腺炎多器官損害與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1995，12：131-132.

[5] 王彩花，錢(qián)大可，唐訓(xùn)球.急性胰腺炎的腎損害49例.胃腸病學(xué)，1999，4：51.

[6] Chou CL，Knepper MA，Hoek AN，et al.Reduced water permeability and altered ultrastructure in thin descending limb of Henle in aquaprin-l null mice.J Clin Invest，1999，103：491-496.

[7] Gong H，Wang W，Kwon TH，et al.Reduced renal expression of AQP2，p-AQP2 and AQP3 in haemorrhagic shock-induced acute renal failure.Nephrol Dial Transplant，2003，18：2551-2559.

[8] Entholzner EK，Mielke LL，Calatzis AN，et al.Coagulation effects of a recently developed hydroxyethyl starch(HES130/0.4) compared to hydroxyethyl starches with higher molecular weight.Acta Anaesthesiol Scand，2O00，44：1116-1121.

[9] Feng X，Hu Y，Ding J，et al.Early treatment with hydroxyethyl starch 130/0.4 causes greater inhibition of pulmonary capillary leakage and inflammatory response than treatment instituted later in sepsis induced by cecal ligation and puncture in rats.Ann Clin Lab Sci，2007，37：49-56.

2009-07-28)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.021

福建省自然科學(xué)基金(2008J0086)

350001 福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院普外科

黃鶴光，Email:hhuang2@yahoo.com.cn