李興華 方德寧 沈奕 曾釵明 鄧淑娟

·論著·

胰腺癌患者血清相關(guān)蛋白質(zhì)差異表達(dá)的研究

李興華 方德寧 沈奕 曾釵明 鄧淑娟

目的利用腫瘤血清蛋白質(zhì)組分析方法(serologic proteome analysis，SERPA)對(duì)胰腺癌患者血清和正常人血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組的分析，尋找胰腺癌特異的腫瘤標(biāo)記物。方法利用HPLC柱去除血清中的白蛋白，通過(guò)雙向電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)圖像采集與分析，切取胰腺癌患者血清和正常人血清的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果共獲得4個(gè)差異蛋白質(zhì)。正常人血清含量高而胰腺癌患者血清含量低的蛋白質(zhì)為胍裂解環(huán)化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2)。胰腺癌患者血清含量高而正常人血清含量低的蛋白質(zhì)3個(gè)，分別為結(jié)合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)及KIAA1018蛋白。結(jié)論KIAA1018有望成為胰腺癌篩選和早期診斷的腫瘤標(biāo)記物。

胰腺腫瘤； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 血清蛋白質(zhì)類(lèi)； 腫瘤標(biāo)記，生物學(xué)

胰腺癌的早期診斷是提高患者存活率的關(guān)鍵。為尋找胰腺炎特異性腫瘤標(biāo)記物，提高早期診斷率，目前的研究主要是針對(duì)胰腺癌的致病基因及單個(gè)蛋白質(zhì)的分析。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的出現(xiàn)為尋找腫瘤標(biāo)記物帶來(lái)了希望[1]，而腫瘤血清蛋白質(zhì)組分析法(serologic proteome analysis，SERPA)更是尋找腫瘤相關(guān)抗原的理想手段[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SERPA分析胰腺癌患者和正常人血清中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，為尋找胰腺癌特異的腫瘤標(biāo)記物奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料及實(shí)驗(yàn)儀器

胰腺癌患者血清由長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科提供。正常人血清為健康的獻(xiàn)血者。

固相線(xiàn)性pH梯度干膠條(Immobilized DryStrips,pH3-10,13cm)及N、N-甲叉雙丙烯酰胺均購(gòu)自Amersham Biosciences公司，甘油、TEMED、過(guò)硫酸胺、EDTA購(gòu)自Sigma公司。蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche公司。碘乙酰胺購(gòu)自Fluka Biochemika公司。去除血清中白蛋白的HPLC柱購(gòu)自BIO-RAD公司。

組織勻漿儀(Homogenizer Glas-Col USA)、高速低溫臺(tái)式離心機(jī)(UNIVERSAL 16R ZENTRIFUGEN)、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(SECOMAN France)、IPGphor固相pH梯度電聚焦電泳儀、Electrophoresis Power Supply EPS 3501 XL、垂直電泳系統(tǒng)(Hoefer Electrophoresis Unit SE600 series)均購(gòu)自Amersham Biosciences公司。

二、方法

1．標(biāo)本制備：將HPLC柱(5 ml)事先用0.02 mol/L Na2HPO4(pH 7.1)20～50 ml沖洗、浸泡。將正常血清和胰腺癌患者血清各5 ml分別按0.5 ml/min速度過(guò)柱，取過(guò)柱后的后面3 ml血清，一部分用于檢測(cè)血清白蛋白，另一部分備用。

2．雙向電泳：取除去白蛋白的癌血清及正常血清200 μl,加入DNAse和RNAse各2 μl，與重泡脹液(8 mol/L Urea，2%CHAPS，18 mmol/L DTT，0.5% IPG Buffer，Bromophenol blue trace)50 μl混合，泡漲pH 3～10干膠條(13 cm長(zhǎng))，12 h。等電聚焦程序?yàn)?00 V 1 h→1000 V 1 h→1500 V 3 h→3500 V 8 h，總電壓時(shí)間乘積為30 kVh。等電聚焦后，將IPG膠條放入平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，6 mol/L Urea，30% Glycerol，2% SDS，trace bromophenol blue)進(jìn)行平衡后水平放于12.5% SDS凝膠的頂端進(jìn)行垂直電泳。

3．蛋白質(zhì)染色：采用Amersham Biosciences公司提供的染色方案進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,銀染按文獻(xiàn)報(bào)道優(yōu)化進(jìn)行[3]。

4．圖像采集與分析：染色后的凝膠用PowerLook 2100XL掃描儀掃描，并采用Image Master 2D Elite圖像分析軟件分析。

5．MALDI-TOF MS 質(zhì)譜分析：應(yīng)用ABI的Proteomics System I(上海基康公司)分析，使用胰島素自我分解峰為內(nèi)參照，混合標(biāo)準(zhǔn)肽為外標(biāo)校正。質(zhì)譜參數(shù)為：離子源加速電壓為20 kV，激光波長(zhǎng)為337 nm，脈沖寬度為3 ns。離子延遲提取100 ns。

6．?dāng)?shù)據(jù)庫(kù)檢索： 獲得的肽片斷質(zhì)量數(shù)據(jù)用Protein Prospector中的MS-FIT工具在NCBI的nr(10.15.2003)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。檢索參數(shù)為：最大允許的肽質(zhì)量誤差為0.1 u，每個(gè)肽允許有2個(gè)不完全裂解位點(diǎn)，等電點(diǎn)設(shè)置為3～10，分子質(zhì)量根據(jù)二向電泳提供的表觀(guān)分子質(zhì)量加減10 000作為其范圍。

結(jié) 果

一、雙向電泳結(jié)果

5例正常人血清和5例胰腺癌患者血清經(jīng)雙向電泳分離，一塊膠經(jīng)銀染后大約可見(jiàn)300～500個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖1)，圖像分析不同標(biāo)本、相同組織蛋白質(zhì)的點(diǎn)基本穩(wěn)定，可重復(fù)的蛋白質(zhì)點(diǎn)在95%以上。

圖1 血清蛋白的雙向電泳銀染圖

二、正常人及胰腺癌患者血清蛋白質(zhì)的差異

正常人血清與胰腺癌患者血清有4個(gè)含量差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定(圖2)，分別為胍裂解環(huán)化酶激活蛋白2(guanylate cyclase-activating protein 2)、結(jié)合珠蛋白2α(haptoglobin 2 alpha)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，or prealbumin, amyloidosis type Ⅰ)、KIAA1018蛋白。正常人血清guanylate cyclase-activating protein 2含量明顯高于胰腺癌患者；而其他3種蛋白，胰腺癌患者血清含量明顯高于正常人。

a：胍裂解環(huán)化酶激活蛋白2；b：結(jié)合珠蛋白2α；c：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白；d：KIAA1018蛋白

圖2質(zhì)譜分析圖

討 論

已有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，應(yīng)用腫瘤血清蛋白質(zhì)組分析方法對(duì)肺癌、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、肝癌以及卵巢癌等多種腫瘤患者血清進(jìn)行分析。 本研究對(duì)胰腺癌患者血清進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)差異蛋白質(zhì)。

結(jié)合珠蛋白屬于α2球蛋白組分中的一種糖蛋白，由位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的兩個(gè)等位基因所編碼。它能與血紅蛋白穩(wěn)定結(jié)合，具有遺傳多態(tài)現(xiàn)象，是血清遺傳學(xué)的一個(gè)重要標(biāo)志物[6]。Awadallah等[7]報(bào)道，結(jié)合珠蛋白基因和惡性淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌等發(fā)生有一定的關(guān)系。結(jié)合珠蛋白具有非特異性免疫防御功能，可抑制流感病毒的血凝集反應(yīng)，對(duì)那些生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中需要亞鐵血紅素的致病菌亦有抑制作用。此外，結(jié)合珠蛋白還是前列腺素合成酶復(fù)合物的內(nèi)源性抑制物；結(jié)合珠蛋白與血紅蛋白復(fù)合物還可刺激膠原的合成。結(jié)合珠蛋白的合成與分解主要在肝臟進(jìn)行，正常情況下，能保持相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡，但在動(dòng)脈硬化、溶血性貧血、肝細(xì)胞損害時(shí)血清結(jié)合珠蛋白顯著降低。炎癥、損傷、傳染病、白血病、風(fēng)濕病、缺血性心臟病、淋巴肉芽腫、系統(tǒng)性硬皮病、各種惡性腫瘤以及放射病時(shí)血清結(jié)合珠蛋白水平明顯升高。本結(jié)果顯示胰腺癌患者血清結(jié)合珠蛋白含量明顯升高，其在胰腺癌發(fā)生中的作用還有待于進(jìn)一步地研究。

轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白又稱(chēng)維生素A運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，相對(duì)分子量為54 000，由4個(gè)相同的亞單位組成[8]。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白主要由肝細(xì)胞合成。早在1984年就發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白基因發(fā)生突變時(shí)，機(jī)體心肌及神經(jīng)系統(tǒng)可發(fā)生廣泛淀粉樣病變[9]。肝實(shí)質(zhì)受損傷的急、慢性肝炎患者血清中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白含量明顯降低，原發(fā)性肝癌患者血清中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白含量也明顯下降。轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白在胰腺和肝臟的胚胎發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[10]。本組胰腺癌患者血清中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白明顯升高，與胰腺癌的相關(guān)性也需要進(jìn)一步的大樣本的比對(duì)研究。

KIAA類(lèi)基因是一類(lèi)從腦組織cDNA文庫(kù)中獲得的編碼大分子蛋白的功能未知的基因，KIAA1018在不同組織、細(xì)胞中的表達(dá)不同，功能各異，有的參與了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[11-13]。 Lee等[14]報(bào)道，在耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中，KIAA表達(dá)增強(qiáng)；在低分化的膀胱癌細(xì)胞株中，KIAA基因表達(dá)也增強(qiáng)。Sugita等[15]報(bào)道，KIAA在神經(jīng)上皮腫瘤中高表達(dá)。KIAA家族成員眾多， 本結(jié)果顯示，KIAA1018在胰腺癌患者血清中含量很高，而正常人血清中未檢測(cè)到。通過(guò)對(duì)其功能以及其他消化道腫瘤患者血清中KIAA1018含量的檢測(cè)，我們認(rèn)為其有望成為胰腺癌高危人群篩選和早期診斷的腫瘤標(biāo)記物，我們將作深入研究。

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2010-01-25)

(本文編輯：屠振興)

Differentialexpressionofserumproteinsofpancreaticcancerpatients

LIXing-hua,FANGDe-ning,SHENYi,CENGChai-ming,DENGShu-juan.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiEighthPeople′sHospital,Shanghai200235,China

LIXing-hua,Email:lixinghua2002@yahoo.com.cn

ObjectiveSerologic proteome analysis method (SERPA) was used to compare the different of the serum proteins between normal and pancreatic cancer patients′ serum, and to find a new specific pancreatic cancer marker.MethodsHPLC was used to eliminate albumin from the serum, two-dimensional electrophoresis was used to separate the proteins. After imaging collection and analysis, the different proteins between pancreatic cancer and normal subjects were cut for mass spectrometry.ResultsFour discrepancy proteins were obtained. Guanylate cyclase-activating protein 2 was highly expressed in normal serum but not pancreatic cancer. Hp2-alpha, transthyretin and KIAA1018 protein were highly expressed in cancer patients′ serum but not normal people.ConclusionsKIAA1018 may become a promising tumor marker for screening and early diagnosis of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Proteonics; Serum proteins; Tumor markers,biological

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.007

國(guó)家自然科學(xué)基金(30370646)；上海市自然科學(xué)基金(09ZR1423800)

200235 上海，上海市第八人民醫(yī)院消化內(nèi)科

李興華，Email:lixinghua2002@yahoo.com.cn