張云楚,紀(jì) 宇

(江蘇省食品藥品檢驗所,江蘇 南京 210008)

胎盤多肽注射液又名升血肽注射液,多用于治療細(xì)胞免疫功能降低或失調(diào)引起的疾病、手術(shù)后愈合、病毒性感染引起的疾病及各種原因所致的白細(xì)胞減少癥,各種傳染性疾病和手術(shù)創(chuàng)傷的愈合。該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)WS-10001-(HD-1430)-2003中,該標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測定,經(jīng)查文獻(xiàn),未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)期刊有胎盤多肽注射液含量測定方法的報道。目前測定多肽含量的常用方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、Folin-酚法(lowry法)、雙辛可寧酸(Bicinchoninic acid,BCA)法[1]等。但上述方法多數(shù)需消耗的多肽量較大,僅 BCA法和Folin-酚法適用于低濃度多肽溶液的含量測定,但在我們的研究工作中發(fā)現(xiàn) Folin-酚法樣品比色后吸光度值太低,測定誤差較大。這也是國家標(biāo)準(zhǔn)遲遲未增訂含量測定標(biāo)準(zhǔn)的原因。所以本文對BCA法測定胎盤多肽注射液中低濃度多肽含量的方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與藥品

PE Lambda 35紫外可見分光光度計,美國 PE公司。

牛血清白蛋白(BSA)對照品(批號:140619-200617)、酪蛋白對照品(批號:601-200221),中國藥品生物制品檢定所;胎盤多肽注射液(批號:20070907,20071021,20071242),貴州黔峰生物制品有限公司;BCA(批號:14335),Fluka公司;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 BCA法

BCA法的原理是堿性條件下,蛋白將 Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物,測定其在562 nm波長處的吸光度值,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比,計算待測蛋白的含量。

參考美國藥典方法[2],精密量取供試品溶液2.0mL,加入Cu-BCA試液4.0mL混勻,計時,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 30 min,以水為空白,562 nm波長處測定吸光度;以BSA為對照品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.1 測定低濃度多肽含量恰當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)蛋白線性范圍的考察 以BSA對照品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),加水制成每1mL中約含0.2mg的溶液。精密量取對照品溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,分別置具塞試管中,各加水至2.0mL,再加入Cu-BCA試液4.0mL混勻,計時,37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 30 min,放冷至室溫,在562 nm的波長處測定吸光度(A)值;同時以0號管作為空白。以A為縱坐標(biāo),以對照品濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,多次試驗的結(jié)果表明:BSA濃度在19.2～115.2μg/mL范圍內(nèi),與A呈良好的線性關(guān)系,r≥0.999 0。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的重現(xiàn)性試驗 以BSA對照品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),1周內(nèi)制作 5次標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1?？梢?BCA法在BSA濃度為19.2～115.2 μg/mL范圍內(nèi)與A線性關(guān)系好,并且重現(xiàn)性好。

表1 BSA濃度為19.2～115.2μg/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及r值Tab.1 BSA calibration curves equation and the correlation coefficient in the range of 19.2-115.2μg/mL

2.1.3 加樣回收率試驗 由于BSA對照品凍干分裝于安瓿中(非化學(xué)純品),規(guī)格為19.2mg/支,無法精密稱取,故取對照品 9支分別加水溶解并稀釋成28.80,48.00,69.12μg/mL,每個濃度各 3份。取已知含量的樣品溶液1.0mL分別加入3種濃度的對照品溶液1.0mL,混勻,作為供試品溶液。照含量測定項下方法操作,結(jié)果見表2。平均回收率為102.2%,RSD(n=9)為3.8%。

2.1.4 重復(fù)性試驗 分別取同批樣品 6份,照含量測定項下方法測定含量,RSD為0.6%。

2.1.5 溶液的穩(wěn)定性考察 制備的對照品溶液與供試品溶液在室溫放置不同時間,測定A值,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,對照品溶液和供試品溶液隨時間推移,A值緩慢增加。對照品溶液和供試品溶液A值增加程度并不完全一致,故含量測定條件應(yīng)計時 37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng) 30 min,放冷至室溫(10 min),測定。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Determination results and recovery of the BSAin samples

表3 溶液的穩(wěn)定性考察Tab.3 Investigation of the stability of the solution

2.2 BCA法與Folin-酚法、雙縮脲法、凱氏定氮法進(jìn)行比較

分別采用氮測定法(半微量定氮法)、雙縮脲法、福林酚法分別測定胎盤多肽注射液的含量。

2.2.1 采用氮測定法(半微量定氮法)[3]發(fā)現(xiàn)樣品中的蛋白含量很低,樣品如果不濃縮,直接采用上述方法測定達(dá)不到該方法的最低定量限的要求。

2.2.2 采用雙縮脲法[4]分別以酪蛋白、BSA為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。比色過程中發(fā)現(xiàn),供試品溶液比色后顏色與對照品比色后基本一致,但有混濁乳光,過濾或離心均不能解決問題,導(dǎo)致供試品溶液吸光度偏高,測定結(jié)果偏高,誤差較大。

2.2.3 采用Folin-酚法[3]分別以酪蛋白、BSA為蛋白對照品,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差。直接以本品做為供試品溶液測定,樣品比色后吸光度太低(僅約0.08),含量測定易受干擾物質(zhì)影響,測定誤差較大。

2.2.4 采用BCA法 以BSA為對照品,采用BCA試劑比色,檢測波長562 nm。該法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好,直接將樣品作為供試品溶液;含量測定不易受干擾物質(zhì)影響。供試品溶液吸光度均在0.3～0.7之間。最終確定BCA法為本品含量測定的最佳方法。

2.3 BCA法含量測定結(jié)果

采用BCA法測定了3批胎盤多肽注射液(批號:20070907,20071021,20071224)中多肽的含量,結(jié)果(以BSA計)分別為:50.0,50.4和51.1μg/mL。

3 討 論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展,許多生物制品及多肽類藥物生產(chǎn)工藝中所得多肽溶液的含量低、純化難,不易制得,但作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制,其多肽含量必需明確且可控,故探索低濃度多肽含量的方法具有非常重要的現(xiàn)實意義。

本文通過考察 BCA法在19.2～115.2μg/mL范圍內(nèi)效能指標(biāo),探索建立 BCA法測定胎盤多肽注射液中低濃度多肽的含量的方法。結(jié)果表明,在此范圍內(nèi)樣品溶液的吸光度適中(0.3～0.7),有良好的線性關(guān)系,精密度高,準(zhǔn)確度好。

文獻(xiàn)報道[5]Folin-酚法適合于低濃度蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)的含量測定,但 BCA法對比 Folin-酚法在低濃度多肽含量測定中更加優(yōu)越。Folin-酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差,樣品比色后吸光度太低,含量測定易受干擾物質(zhì)影響,測定誤差較大。而BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好,樣品比色后吸光度適中,含量測定不易受干擾物質(zhì)影響,且該方法快速(30 min內(nèi)完成測定,比經(jīng)典的Folin-酚法快 4倍)。由此可見,BCA法更適于低濃度多肽的含量測定。

[1]吳梧桐.生物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:75-76.

[2]USP[S].32ed.2008:516.

[3]中國藥典[S].二部.2005:附錄 43-附錄 44,附錄 152.

[4]白秀峰.生物藥物分析[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2002:282.

[5]王愛軍,王鳳山,王友聯(lián),等.低濃度蛋白質(zhì)含量測定方法的研究[J].中國生化藥物雜志,2003,24(2):78-80.