吳慧平,哈團(tuán)柱,郜 明

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210029;2.美國(guó)東田納西洲洲立大學(xué),Johnson City,TN 37614,USA)

2型糖尿病的發(fā)生,與葡萄糖耐量缺損相關(guān)。由于β細(xì)胞第一相分泌障礙,使葡萄糖耐量下降,葡萄糖耐量缺損臨床上表現(xiàn)為餐后高血糖[1]。餐后高血糖是大血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與視網(wǎng)膜病變、頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層增厚、心肌血容量和血流量下降、癌癥風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)[2]。干預(yù)葡萄糖耐量缺損有效措施,即控制餐后高血糖,可以使高?；颊咧?1/3的人血糖恢復(fù)正常;1/3的人避免轉(zhuǎn)化為糖尿病。因此,降低餐后高血糖,對(duì)2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展,以及大血管疾病的預(yù)防具有非常重要的意義。

降低餐后血糖水平,涉及到碳水化合物消化與吸收過(guò)程中的α-糖苷酶類(lèi)、載體,如單糖在吸收環(huán)節(jié)上鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體 1(sodium glucose cotransporters 1,SGLT1)和葡萄糖協(xié)助擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)載體 2(facilitative glucose transporters 2,GLUT2)、Na+-K+-ATP酶、胃腸激素刺激胰島素早期分泌等因素,其中任何環(huán)節(jié)被阻斷都能延緩單糖吸收和降低餐后血糖水平。

我們以往的研究提示,夏枯草提取物可能通過(guò)抑制α-淀粉酶、α-麥芽糖酶活性,而提高正常和四氧嘧啶糖尿病模型 ICR小鼠的淀粉耐量,以及提高正常 ICR小鼠的麥芽糖耐量,降低餐后高血糖[3-6]。為了探討夏枯草提取物對(duì)碳水化合物水解和葡萄糖吸收影響的作用機(jī)制,本研究以Caco-2細(xì)胞為研究對(duì)象,采用藥物干預(yù)的方式,觀察了夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶 mRNA水平和影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體 SGLT-1、GLUT-2及Na+-K+-ATP酶的mRNA水平表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

夏枯草(Prunella vulgaris L.)為唇形科植物夏枯草的干燥果穗,2008年夏產(chǎn)于江蘇省句容縣,由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院陳建偉教授鑒定。

阿卡波糖片(拜糖平),50mg/片,Bayer公司;Trizol RNA抽提試劑 (No.15596-018)、GeneAmp Gold RNA PCR core試劑 (No.4308267)、GeneAmp RNA control試劑(No.4308238),invitrogen公司;100 bp DNA ladder(No.27762603)promega公司 ;引物均由XXIDT?公司合成:SGLT-1(上游 5′-CTCTTCACCATGGACATCTAC-3′;下游 5′-GATAATCGTGGGACAGTTGCT-3′);GLUT-2(上游 5′-CACTGATGCTGCATGTGGC-3′;下游 5′-ATGTGAACAGGGTAAAGGCC-3′);Na+-K+-ATP酶 (上游5′-TGGATAACTCCTCGCTCACT-3′;下游 5′-ATTGGCTACGATGATACCG-3′);α-葡萄糖苷酶(上游 5′-AAGCAGAGCCTGTGTGCGGG-3′;下游 5′-CACAGAGCAGCCCTCCAGGC-3′);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(上游 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′;下游 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。

1.2 儀器

Isotempx細(xì)胞培養(yǎng)箱;MP-STTMPhotographic成像系統(tǒng);PTC-100TMprogrammable Thermal Controller PCR儀;E-CMidicellTMEC350電泳系統(tǒng)。

1.3 Caco-2細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞,ATCC公司;DMEM培養(yǎng)基 +10%FBS,10mg氨芐青霉素,10mg鏈霉素,1%非必需氨基酸(NEAA),均購(gòu)自 Gibco公司。

1.4 夏枯草提取物的制備

1.4.1 夏枯草水提物的制備 干燥夏枯草稱(chēng)重后,漂洗、剪碎、冷水浸泡后,直火加熱煎煮,過(guò)濾,重復(fù)煎煮 2次,藥液合并,冷卻后離心,隔水濃縮后,冷凍干燥,得率為14.86%,用ddH2O溶解藥物儲(chǔ)備,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前過(guò)濾藥物,用培養(yǎng)基稀釋藥物至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.4.2 夏枯草浸膏和多糖的制備 在夏枯草水提物中加入一定量的95%乙醇,4℃冰箱過(guò)夜,離心,上清液濃縮為浸膏,得率為5.97%。醇沉物經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚分步脫水得到夏枯草灰白色粗多糖粉末,得率為8.56%,其費(fèi)林試劑、碘試劑反應(yīng)均為陰性,α-萘酚試劑反應(yīng)呈紫紅色。

1.5 夏枯草提取物的細(xì)胞毒性測(cè)定

將匯合度密度為2×105的Caco-2細(xì)胞接種于6孔板中(3個(gè)復(fù)孔),待細(xì)胞貼壁后,分別加入不同濃度的藥物,即夏枯草水提物(3,1.5,0.75,0.375,0.1875μg/mL),(相當(dāng)于生藥 40.38,20.19,10.095,5.048,2.524μg/mL);夏枯草浸膏(1,0.5,0.25,0.125,0.0 625μg/mL)(相當(dāng)于生藥13.46,6.73,3.365,1.68,0.84μg/mL);夏枯草多糖(2,1,0.5,0.25,0.125μg/mL)(相當(dāng)于生藥 26.92,10.46,5.23,2.615,1.31μg/mL);阿卡波糖(50,25,12.5,6.25,3.125μg/mL),待藥物作用24 h后,用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用,選擇合適的藥物作用濃度。

1.6 RNA提取及PCR反應(yīng)

Caco-2細(xì)胞(3個(gè)復(fù)孔),以2×105的密度接種于6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后匯合度達(dá) 70%左右,加入藥物(篩選濃度)處理24h。使用Trizol試劑常規(guī)方法提取總 RNA。并取RNA 0.8μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后進(jìn)行 PCR反應(yīng),反應(yīng)體系 25 μL。

α-葡萄糖苷酶 PCR反應(yīng)條件:94℃,5 min預(yù)變性;94℃,45 s變性;60℃,45 s退火;72℃,45s延伸;循環(huán)35次;再72℃,10 min;4℃,2h。其中MgCl2濃度為2 mmol/L,擴(kuò)增產(chǎn)物片斷為292 bp。

SGLT-1、GLUT-2和Na+-K+-ATP酶 PCR反應(yīng)條件:94℃,5min預(yù)變性;94℃,45 s變性;55℃,45s退火;72℃,45 s延伸;循環(huán)35次;再72℃,10 min;4℃,2h。其中mgCl2濃度為1.5mmol/L,擴(kuò)增產(chǎn)物片斷為354,525,385 bp。

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳,經(jīng)溴乙錠染色拍照,其電泳 PCR DNA條帶的密紋灰度,由Alpha-EaseFc掃描計(jì)算其灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 夏枯草提取物對(duì)細(xì)胞毒性的影響

夏枯草水提物在0.75μg/mL,其浸膏和多糖分別在0.25和0.5μg/mL的濃度,阿卡波糖在25 μg/mL均未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。故后續(xù) PCR試驗(yàn)中藥物濃度均按篩選后濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

2.2 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞α-葡萄糖苷酶mRNA的表達(dá)影響

結(jié)果如圖1。藥物作用24 h后,與陰性對(duì)照組相比,夏枯草三種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶 mRNA水平表達(dá)均有一定的抑制作用(P＜0.05),其抑制作用與陽(yáng)性藥阿卡波糖相似。

2.3 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞SGLT-1及GLUT-2mRNA的表達(dá)影響

結(jié)果如圖2。藥物作用24h后,與陰性對(duì)照組比較,夏枯草三種提取物對(duì)SGLT-1的mRNA表達(dá)均有一定的抑制作用(P＜0.05),其中夏枯草水提物的作用更為明顯(P＜0.01);對(duì)GLUT-2mRNA表達(dá)均呈極顯著差異(P＜0.01)。

圖1 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞α-葡萄糖苷酶 mRNA的表達(dá)影響(n=3,±s)Fig.1 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions ofα-glucosidase mRNA in Caco-2cells(n=3,±s)

2.4 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞Na+-K+-ATP酶mRNA的表達(dá)影響

圖2 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞對(duì)SGLT-1mRNA(A)和GLUT-2mRNA(B)的表達(dá)影響(n=3,±s)Fig.2 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions of SGLT-1mRNA(A)and GLUT-2 mRNA(B)in Caco-2 cells(n=3,±s)

如圖3所示,藥物作用24 h后,與陰性對(duì)照組相比,夏枯草三種提取物對(duì)Na+-K+-ATP酶的mRNA水平表達(dá)均有一定的抑制作用(P＜0.05),而夏枯草水提物的作用更為顯著(P＜0.01)。

圖3 夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞Na+-K+-ATP酶 mRNA的表達(dá)影響(n=3,±s)Fig.3 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions of Na+-K+-ATPase mRNA in Caco-2 cells(n=3,±s)

3 討 論

機(jī)體對(duì)碳水化合物消化過(guò)程由α-糖苷酶類(lèi)參與,其活性和含量是碳水化合物水解成為葡萄糖的關(guān)鍵步驟。葡萄糖吸收的整個(gè)過(guò)程由2個(gè)家族的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白——SGLT1和GLUT2參與[6-7]。而起主導(dǎo)作用的是位于小腸細(xì)胞黏膜表面上的SGLT1,該蛋白在其基底膜細(xì)胞Na+-K+-ATP酶作用下逆 Na+濃度差,通過(guò)消耗能量,主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[8-9]?？梢?jiàn) SGLT1載體數(shù)量,是葡萄糖吸收的決定因素。GLUT2位于基底膜以易化擴(kuò)散方式順葡萄糖的濃度梯度,把腸黏膜細(xì)胞內(nèi)聚集葡萄糖協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)到組織間隙液,進(jìn)而葡萄糖進(jìn)入血液,其轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程不消耗能量[10]。如此,腸道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT1、GLUT2及Na+-K+-ATP酶 3個(gè)蛋白[11]。

經(jīng)過(guò)夏枯草提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶,SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶在mRNA水平的研究,我們觀察到夏枯草提取物能明顯降低 α-葡萄糖苷酶,SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶的mRNA表達(dá),綜合前期研究表明,夏枯草提取物能降低正常和四氧嘧啶糖尿病模型 ICR小鼠餐后血糖水平,不僅涉及直接抑制α-糖苷酶活性,而且在長(zhǎng)期時(shí)間給藥條件下,可能抑制參與葡萄糖吸收的這些靶點(diǎn)基因的表達(dá)。

阿卡波糖屬α-葡萄糖苷酶抑制劑,但其對(duì)α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶基因表達(dá)影響如何,尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶mRNA表達(dá)存在抑制作用為新發(fā)現(xiàn),還有待在多次給藥的整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

夏枯草提取物有類(lèi)似于阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制劑作用[3-4]以及對(duì) α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶 mRNA表達(dá)也有同樣的發(fā)現(xiàn),提示夏枯草提取物對(duì)干預(yù)葡萄糖耐量缺損和肥胖癥均有一致意義。也表明其可能會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似于阿卡波糖的胃腸道反應(yīng)。夏枯草提取物抑制單糖吸收相關(guān)基因表達(dá)作用的發(fā)現(xiàn),將為其干預(yù)葡萄糖耐量缺損的進(jìn)一步研究提供了更多依據(jù)。

[1]Ceriello A,Colagiuri S.International diabetes federation guideline for management of postmeal glucose:a review of recommendations[J].Diabet Med,2008,25(10):1151-1156.

[2]Alice Y Y C,George F.Oral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetes mellitus[J].CMAJ,2005,172(2):213-226.

[3]莊玲玲,丁婷,吳慧平.夏枯草提取物對(duì)α-淀粉酶抑制作用的初步研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(19):2243-2245.

[4]吳慧平,張喆,丁婷,等.夏枯草提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(5):361-363.

[5]郭英,李桂梅,郜明,等.夏枯草水提物對(duì)ICR小鼠餐后高血糖的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,29(1):70-73.

[6]吳慧平,陳美娟,郜明,等.夏枯草水提物延緩正常 ICR小鼠單糖吸收作用研究[J].中藥材,2010,33(5):782-785.

[7]Gould G W,Holman G D.The glucose transporter family:structure,function and tissue-specific expression[J].Biochem J,1993,295(Pt 2):329-341.

[8]Joost H G,Wandel S,Schurmann A.Structure function relationship of glucose transporters catalyzing facilitated diffusion[J].Exp Clin Endocrinol,1994,102:434-438.

[9]Dyer J,Daly K,Salmon K S,etal.Intestinal glucose sensing and regulation of intestinal glucose absorption[J].Biochem Soc Trans,2007,35:1191-1194.

[10]Zhou L,Cryan E V,D′Andrea M R,etal.Human cardiomyocytes express high level of Na+/glucosecotransporter 1(SGLT1)[J].J Cell Biochem,2003,90:339-346.

[11]Kellett G L,Brot-Laroche E,Mace O J,etal.Sugar absorption in the intestine:the role of GLUT2[J].Annu Rev Nutr,2008,28:35-54.