王伯華，許 楊，，*，李燕萍

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

橙色紅曲菌乳清苷-5'-磷酸脫羧酶基因的克隆

王伯華1，許 楊1，2，*，李燕萍2

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

根據(jù)已報道的真菌乳清苷-5′-磷酸脫羧酶（pyrG）氨基酸序列，采用CODEHOP策略設(shè)計簡并引物，從橙色紅曲菌（Monascus aurantiacus）的基因組DNA中克隆得到pyrG基因片段。然后運(yùn)用PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫，獲得了pyrG基因全長（GenBank登錄號：GU723506）。經(jīng)過blastx比較發(fā)現(xiàn)，橙色紅曲菌pyrG基因與Aspergillus flavus NRRL3357的氨基酸序列同源性最高，達(dá)到81%。該基因能夠作為篩選標(biāo)記應(yīng)用于橙色紅曲菌同源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

橙色紅曲菌，簡并引物，pyrG基因，基因克隆

乳清苷-5′-磷酸脫羧酶是尿嘧啶核苷酸合成途徑中的一種關(guān)鍵性酶，缺乏該酶的營養(yǎng)缺陷株不能在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長。通過基因轉(zhuǎn)化，向其導(dǎo)入含pyrG基因的質(zhì)粒，可使其恢復(fù)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的能力。如果將要導(dǎo)入的基因連接在該質(zhì)粒上，pyrG可作為外源基因是否導(dǎo)入的標(biāo)志［1］。紅曲菌（Monascus）是我國傳統(tǒng)的釀造微生物，能產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物：紅曲色素［2］、Monacolin類化合物［3］、γ-氨基丁酸［4］等。近年來，歐美等國對紅曲菌的研究興趣也在不斷增加［5-6］。本實驗采用CODEHOP（ Consensus - Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primer）PCR結(jié)合 PCR篩選紅曲菌Fosmid文庫的方法克隆了橙色紅曲菌pyrG基因全長，該基因的獲得為橙色紅曲菌同源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立奠定了基礎(chǔ)，也為紅曲菌及其它真菌的新基因克隆提供了一個有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙色紅曲菌AS3.4384 購自中國科學(xué)院微生物研究所；E.coli DH5α 購自Novagen公司；橙色紅曲菌Fosmid文庫 由本實驗室李燕萍博士構(gòu)建；Taq酶、T4連接酶、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒 均購自TaKaRa公司；引物 Invitrogen公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 簡并引物的設(shè)計 根據(jù)在NCBI上已經(jīng)公布的真菌pyrG基因的氨基酸序列，采用CODEHOP［7］策略設(shè)計一對簡并引物：

1.2.2 pyrG基因片段的擴(kuò)增 采用氯化芐法從橙色紅曲菌菌絲體中提取基因組DNA［8］，并以此為模板，用OMP-F和OMP-R引物進(jìn)行簡并PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行 TA克隆，初步篩選陽性克隆子后送Invitrogen公司測序，得到橙色紅曲菌pyrG基因片段序列。

表1 橙色紅曲菌pyrG基因與其它真菌的同源性比較

1.2.3 PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫 根據(jù)測序所得pyrG基因片段序列設(shè)計一對特異性引物，用于篩選Fosmid文庫：

橙色紅曲菌Fosmid文庫保存于21塊384微孔板中，將每一塊孔板的384個克隆子混合培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA，分別命名為Q1～Q21，作為PCR法篩選文庫的模板DNA。當(dāng)確定陽性克隆子所在的孔板后，分別提取陽性孔板中的每行（編號為A～P）和每列（編號為1～24）的質(zhì)粒DNA，用作PCR方法定位單克隆子的模板DNA。進(jìn)一步用PCR驗證單克隆子后提取其質(zhì)粒DNA備用。

1.2.4 OMPD基因全長的獲得 用各種限制性內(nèi)切酶對陽性Fosmid單克隆子質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將1～5kb的酶切片段分別進(jìn)行回收、克隆、測序。采用DNASTAR軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得pyrG基因全長序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 pyrG基因片段的克隆與分析

以橙色紅曲菌AS3.4384基因組DNA為模板，OMP-F和OMP-R為簡并引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)退火溫度選擇上，從47～63℃設(shè)置了溫度梯度，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在431bp的位置出現(xiàn)目的條帶（圖1）。由圖1可以看出，退火溫度低于60℃時會產(chǎn)生許多非特異性條帶，當(dāng)退火溫度達(dá)到63℃時出現(xiàn)特異性目的條帶。

圖1 不同退火溫度下簡并PCR擴(kuò)增結(jié)果

簡并PCR的特異性產(chǎn)物TA克隆后送公司測序。測序結(jié)果應(yīng)用blastx程序進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明，由克隆所得基因片段推測的氨基酸序列具有pyrG基因的典型保守區(qū)域，可以基本確認(rèn)所獲得的DNA片段是橙色紅曲菌pyrG基因的部分序列。

2.2 橙色紅曲菌Fosmid文庫的篩選

以Q1～Q21板池混合質(zhì)粒作為模板，OMP-S1和OMP-S2為引物進(jìn)行PCR篩選，能夠擴(kuò)增pyrG目的條帶的有：Q6、Q12、Q17。然后制備Q12板的行池（A～P）和列池（1～24），以這些小混合池作為模板，采用PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增pyrG基因片段，F(xiàn)行、9列能夠擴(kuò)增出目的條帶。根據(jù)篩選結(jié)果，可初步確定陽性克隆子為Q12F9，提取Q12F9單克隆子質(zhì)粒作為模板，采用 PCR反應(yīng)對其進(jìn)一步驗證，能夠觀察到360bp的目的條帶（圖2）。

圖2 PCR法篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫

2.3 pyrG基因全長的克隆與分析

選用幾種常用的限制性內(nèi)切酶對Q12F9質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果如圖3。將1～5kb的酶切片段分別進(jìn)行回收、克隆，經(jīng)PCR驗證含有pyrG基因片段的陽性克隆子送公司測序。測序結(jié)果拼接后獲得了pyrG基因全長。通過blastx檢測與其它真菌的同源性大小（表 1），發(fā)現(xiàn)橙色紅曲菌 pyrG基因與Aspergillus flavus NRRL3357的pyrG氨基酸同源性達(dá)到81%，說明克隆所得基因為pyrG基因。

圖3 限制性內(nèi)切酶酶切Q12F9電泳圖

3 討論

傳統(tǒng)簡并引物設(shè)計思路是對與目標(biāo)基因親緣關(guān)系比較近的氨基酸序列進(jìn)行對比后，根據(jù)其保守序列和密碼子的簡并性設(shè)計出長度在18～23bp的引物序列。由于傳統(tǒng)引物很少考慮到物種的密碼子偏好性，簡并度較高，同時傳統(tǒng)簡并引物的Tm值一般都比較低，這些因素往往導(dǎo)致PCR結(jié)果不理想，特異性不高，假陽性率增加。本研究通過CODEHOP策略來設(shè)計簡并引物，引物3′端為核心簡并區(qū)，5′端為非簡并性夾板結(jié)構(gòu)，5′端夾板結(jié)構(gòu)是根據(jù)不同物種密碼子偏好性設(shè)計的特異性序列［9］。它大大減少了引物的簡并度且不影響引物的有效性，與傳統(tǒng)方法設(shè)計的簡并引物相比，具有擴(kuò)增特異性高、PCR反應(yīng)條件易摸索的優(yōu)點(diǎn)。

常規(guī)篩選基因組文庫的方法是通過菌落雜交或?qū)⑴帕性谖⒖装逯械膯慰寺?fù)制到尼龍膜上篩選陽性克隆［10-11］，費(fèi)時費(fèi)力。Green［12］首先提出了采用PCR方法篩選混合池快速定位陽性克隆子，為篩選單克隆減少了很大的工作量，避免了人力和物力的浪費(fèi)。

本研究采用CODEHOP PCR結(jié)合PCR篩選橙色紅曲菌Fosmid文庫的方法克隆了橙色紅曲菌pyrG基因全長，為紅曲菌及其它真菌新基因的克隆提供了一個有效的途徑。該基因全長的獲得為橙色紅曲菌同源轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

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［6］Campoy S，Pérez F，Martín J F，et al.Stable transformation of the azaphilone pigment-producing Monascus purpureus obtained by protoplast transformation and Agrobacterium-mediated DNA transfer［J］.Curr Genet，2003，43：447-452.

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Cloning of Orotidine-5′-phosphate decarboxylase gene from Monascus aurantiacus

WANG Bo-hua1，XU Yang1，2，*，LI Yan-ping2
（1.State key laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Sino-Germany Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

According to the known Orotidine-5′-phosphate decarboxylase，pyrG gene fragment was cloned from Monascus aurantiacus genomic DNA using degenerate primers designed with CODEHOP strategy.And its complete sequence was obtained by a PCR-based method for screening fosmid library（Accession No.GU723506）. After the blastx comparison，the cloned gene was confirmed that it was Monascus pyrG gene with 81%sequence identity to that of Aspergillus flavus NRRL3357.lt can use as a selective marker for Monascus aurantiacus homologus transformation system.

Monascus aurantiacus；degenerate primer；pyrG gene；gene cloning

Q785

A

1002-0306（2010）11-0172-03

2010-04-20 *通訊聯(lián)系人

王伯華（1981-），女，博士研究生，主要從事食品生物技術(shù)方向的研究。

國家自然科學(xué)基金（30860123）。